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黄芩素对STM感染小鼠的治疗作用分析
发布时间:2021-01-20

  摘    要: 试验研究黄芩素对感染鼠伤寒沙门氏菌(STM)小鼠的影响。将80只小鼠分为空白组、STM组、黄芩素+STM组和黄芩素组。结果显示:STM使感染小鼠的存活率明显下降,小鼠血清中炎性因子水平明显增高,脏器指数降低,肝脏和脾脏组织呈现明显的病理改变。黄芩素可使感染STM小鼠的存活率明显升高,小鼠血清中炎性因子水平降低,脏器指数升高,肝脏和脾脏的病理变化明显改善。研究表明,黄芩素对STM感染的小鼠有治疗作用。

  关键词: 黄芩素; 鼠伤寒沙门氏菌; 小鼠;

  Abstract: The experiment was to study the effect of baicalein on mice infected with Salmonella typhimurium. 80 mice were divided into blank group, STM group, baicalein+STM group and baicalein group. The results showed that STM reduced the survival rate of infected mice, increased the level of inflammatory factors in serum, decreased the organ index, and showed obvious pathological changes in liver and spleen tissues. Baicalein increased the survival rate of STM-infected mice, reduced the level of inflammatory factors in serum, increased the organ index, and improved the pathological changes of liver and spleen. The present study confirmed that baicalein has therapeutic effect on mice infected by STM.

  Keyword: Baicalein; Salmonella typhimurium; Mice;

  鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,STM)属于人、畜共患病原菌。由STM所引发的大规模食物中毒事件在国内外均有发生[1]。虽然STM感染健康成年人所引起的症状多为自限性,较易控制和治疗,但对于免疫功能尚未发育完全的幼儿、免疫力与身体机能下降的老人和免疫系统受损的病人来说,感染STM却有致命性[2]。黄芩素,化学名称5,6,7-三羟基黄酮,又名百可利(baicalein),是植物黄芩(Scutellaria radix)中含量最高的黄酮类化合物之一。研究表明,黄芩素具有较强的抗微生物[3]、抗炎、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、保护心血管系统等作用[6],对大肠杆菌、尖孢镰刀菌、白色念珠菌等有显着的抑制作用[7,8]。本课题组前期体外研究发现,黄芩素对STM有显着抑制作用[9]。本试验观察黄芩素对感染STM小鼠的影响,为抗STM感染提供新的治疗方案,为丰富该药的药理作用提供参考。

  1、 材料与方法

  1.1 、试验材料

  1.1.1 、试验菌株

  鼠伤寒沙门氏菌标准株(ATCC14028)购自中国医学微生物菌种保藏中心(National Center for Medical Culture Collection,CMCC)。

  1.1.2、 试验试剂

  黄芩素(批号:20190820)购自西安开来生物工程有限公司(纯度为98%),取适量甲醇溶解、蒸馏水稀释,超净台内过滤后备用;亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)与SS琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司;TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA检测试剂盒购自安诺伦(北京)生物科技有限公司。


黄芩素对STM感染小鼠的治疗作用分析
 

  1.1.3 、试验动物

  健康昆明小鼠,雌、雄各半,体重26~28 g,购自锦州医科大学实验动物研究中心。

  1.1.4 、试验仪器与设备

  SW-CJ-2F双人双面超净工作台购自苏州净化设备有限公司;THZ-300恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司;酶标仪购自美国伯乐i Mark公司;精密电子天平购自Sartorius公司。

  1.2、 试验方法

  1.2.1 、STM悬液制备

  将鼠伤寒沙门氏菌接种于SC培养基中,恒温摇床培养12 h,划线在SS琼脂平板上。恒温培养后,挑取典型STM菌落,再次接种于液体培养基中过夜培养。次日用PBS调整菌液浓度至OD600 nm处吸光值为1.7,离心、洗涤、备用。

  1.2.2 、试验动物分组

  健康昆明小鼠80只,饲养环境保持安静,通风良好,自由采食、饮水。经1周适应性饲养后,随机分为4组,每组20只。空白组、STM组、黄芩素+STM组和黄芩素组。分组后第1 d,空白组和黄芩素组小鼠灌服生理盐水(NS)0.2 m L/只,其余2组小鼠灌服浓度为1×107 CFU鼠伤寒沙门氏菌液0.2 m L/只,灌胃后2 h恢复饲料和饮水的供应。第2 d,空白组和STM组小鼠3次/d灌服NS,每次0.2 m L/只;黄芩素+STM组和黄芩素组小鼠按20 mg/kg灌服黄芩素,3次/d。连续灌胃10 d后,观察各组小鼠存活情况,计算各组存活率。

  1.2.3 、血清细胞因子的测定

  摘除小鼠眼球收集血液于1.5 m L离心管中,室温静置1~2 h;3 000 r/min离心10 min,吸取上清,迅速移至-80℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平。

  1.2.4 、脏器指数的测定

  小鼠断颈处死,去尽肝脏和脾脏表面的结缔组织,称量脏器重量,计算各脏器指数。

  1.2.5 、组织切片的制备

  剪取小块肝脏和脾脏组织,PBS清洗,置于4%多聚甲醛中,室温固定,常规石蜡包埋和HE染色。

  2 、结果与分析

  2.1 、黄芩素对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠存活率的影响(见图1)

  图1 黄芩素对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠存活率的影响
图1 黄芩素对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠存活率的影响

  Fig.1 The effect of baicalein on the survival rate of mice infected with Salmonella typhimurium

  空白组和黄芩素组小鼠生长状态良好、毛发光泽顺滑、精神状态活泼、进食量正常、未见死亡。STM组小鼠感染后,小鼠毛发凌乱无光泽、精神萎靡不振且嗜睡、进食量明显减少,并于感染后第5 d开始出现死亡。由图1可知,5~10 d的存活率分别是80%、70%、60%、45%、30%和25%。黄芩素+STM组小鼠毛发凌乱无光泽、精神萎靡、进食量略微减少,第7 d开始出现死亡。由图1可知,7~10 d的存活率分别是90%、75%、65%和60%。

  2.2、 黄芩素对感染小鼠血清炎性因子的影响(见表1)

  表1 黄芩素对感染小鼠血清中炎性因子的影响(n=5)
表1 黄芩素对感染小鼠血清中炎性因子的影响(n=5)

  注:与空白组相比,*表示差异显着(P<0.05),**表示差异极显着(P<0.01);与STM组相比,#表示差异显着(P<0.05),##表示差异极显着(P<0.01);下表同。

  由表1可知,STM组的4种炎性因子水平均较空白组有显着提高(P<0.01);黄芩素+STM组中的炎性因子水平均极显着低于STM组(P<0.01);而黄芩素组的炎性因子水平与空白组无显着性差异(P>0.05)。

  2.3 、黄芩素对感染小鼠脏器指数的影响(见表2)

  由表2可知,STM组中小鼠的肝脏和脾脏指数极显着低于空白组(P<0.01);黄芩素+STM组的肝脏和脾脏指数显着高于STM组(P<0.05),但与空白组仍有差异(P<0.05或P<0.01);黄芩素组的2个脏器指数与空白组无显着差异(P>0.05)。

  表2 黄芩素对感染小鼠脏器指数的影响(n=5)
表2 黄芩素对感染小鼠脏器指数的影响(n=5)

  2.4 、黄芩素对感染小鼠肝脏和脾脏组织的学影响(见图2、图3)

  图2 黄芩素对感染STM小鼠肝脏的影响(200×)
图2 黄芩素对感染STM小鼠肝脏的影响(200×)

  Fig.2 The effect of baicalein on the liver of mice infected with STM (200×)

  图3 黄芩素对感染STM小鼠脾脏的影响(100×)
图3 黄芩素对感染STM小鼠脾脏的影响(100×)

  Fig.3 The effect of baicalein on the spleen of mice infected with STM (100×)

  由图2可知,空白组小鼠肝小叶结构完整,肝窦清晰、较宽,肝上皮细胞排列整齐、呈多边形,细胞质均匀红染、细胞核清晰;STM组可见一脓腔、肝细胞排列紊乱、细胞核固缩、细胞质部分区分不明显、肝小叶内见小坏死灶、有的呈无结构均质红染、中央静脉和窦状隙扩张、有充血出血,窦状隙内有中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润。与STM组相比,黄芩素+STM组肝小叶结构相对完整、细胞变性数量及程度逐渐降低、肝小叶内坏死灶数量减少、坏死程度减轻、中央静脉和窦状隙扩张程度减小;黄芩素组的肝脏组织结构与空白组类似。

  由图3可知,空白组小鼠的脾脏被膜和小梁结构完整、红髓和白髓界限清晰、细胞形态大小正常;与空白组相比,模型组脾脏的被膜明显增厚、脾小梁增宽、髓质区可见明显淀粉样物质沉积、白髓面积明显减少、红髓内有相当程度的淋巴细胞弥漫性增生和浸润现象;与模型组相比,黄芩素+STM组的脾脏被膜变薄、脾小梁变窄、白髓大小和形态接近正常、组织间隙有大量血细胞;黄芩素组的脾组织形态与空白组接近。

  3、 讨论

  STM主要存在于动物机体消化道内,通过粪便可在动物之间、动物和人之间广泛传播。近年来,由于抗菌药物的大范围使用,多重耐药株的出现已成为临床治疗STM感染面临的严峻问题[10]。目前,尚未见到细菌对中药抗菌成分出现耐药性的报道。因此,寻找抗STM的有效中药为该病的防治提供新思路。本试验结果表明,黄芩素对STM感染的小鼠具有很好的治疗效果。

  作为活化细胞产生的小分子多肽类物质,TNF-α是参与机体免疫应答和炎性反应的重要介质[11]。IL-1则是由单核细胞产生的多肽,可分为IL-1α和IL-1β两种异构体。IL-1β广泛参与组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程[12]。IL-6是机体受到炎症刺激后,由单核巨噬细胞、B细胞、T细胞核内皮细胞等分泌的糖蛋白,具有多种生物学效应,也是导致机体组织或器官严重损伤的重要因子[13]。IL-8属于一种炎症趋化因子,可促进嗜中性多形核白细胞与其结合,释放出大量氧自由基和溶酶体,继而诱发炎症反应[14]。本研究发现,与空白组相比,STM使感染小鼠的存活率明显下降,小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量明显增高,脏器指数则显着降低(P<0.01),肝脏和脾脏组织呈现明显的病理改变。与STM组相比,黄芩素使感染小鼠的存活率明显升高,小鼠血清中炎性因子水平显着降低,脏器指数显着提高(P<0.05),肝脏和脾脏的病理变化有明显改善。上述结果说明,黄芩素可通过降低炎性因子水平、改善肝脏和脾脏的病理变化提高感染STM小鼠的存活率。黄芩素组的各项指标均与空白组接近,且无统计学差异,说明黄芩素对正常小鼠无影响。

  4 、结论

  本试验研究表明,黄芩素对STM感染小鼠的存活率、炎性因子水平、脏器指数、肝脏和脾脏的组织变化均有改善作用。

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