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探讨HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的作用和机制
发布时间:2019-04-15

药学硕士论文范文第三篇:探讨HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的作用和机制

中文摘要

  
  脓毒症是感染引起的全身炎性反应综合征,作为创伤、烧伤、感染等临床危重患者的严重并发症之一,脓毒症是多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsydrome,MODS)的前兆,也是当今危重病医学面临的重大难题。目前普遍认为脓毒症患者病理生理学的变化与革兰阴性菌感染及其裂解产物--内毒素,又称脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)密切相关。LPS进入体内后激活损伤内皮细胞,刺激单核-巨噬细胞,释放出多种氧自由基和炎性介质,引发脓毒症。脓毒症实质上是失控的炎症反应和凝血紊乱。脓毒症时炎性细胞和多种炎介质的释放,激活了凝血系统。炎症反应和凝血激活相互促进、相互影响,使得凝血功能进一步恶化,表现为微血管内微血栓形成,导致微循环障碍,进一步发展为严重脓毒症和脓毒性休克。脓毒症凝血功能障碍是指全身广泛的凝血激活并伴随着极高的出血风险及器官功能衰竭,主要特点是血管内纤维蛋白的形成和清除的失衡,表现为凝血反应增强,抗凝血能力严重减弱,纤维蛋白溶解能力明显下降,同时伴随凝血因子与抗凝物质的大量消耗。凝血功能障碍贯穿脓毒症的整个病理过程,在其中扮演了重要角色,是脓毒症发生发展及预后的关键环节之一。脓毒症导致的凝血功能障碍主要是通过凝血激活、生理抗凝机制下调及纤溶途径抑制导致的。目前认为,组织因子(tissuefactor,TF)触发的外源性凝血途径是脓毒症凝血激活的主要途径。脓毒症时TF主要来源于血管内皮细胞或单核细胞,TF激活循环中的VII因子并与之结合形成的TF-VIIa复合物,随后可通过级联反应使凝血酶原大量激活成为凝血酶。同时,多种途径导致生理性抗凝机制的下调,是导致凝血的另一重要因素。正常机体主要有3个生理性抗凝途径:抗凝血酶III(antithrombinIII,ATIII)、蛋白C(proteinC,PC)系统和组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI),脓毒症时上述抗凝途径均受到了明显抑制。凝血激活后,纤溶系统也随之激活,而脓毒症时,由于纤溶酶原激活物大量产生的纤溶酶原激活物抑制剂-1灭活,导致纤溶系统受到抑制。内皮细胞衬于血管内表面,能够表达多种与抗凝相关的成分,其结构和功能的完整性有助于维持血管内环境稳定,对调节血管张力、维持凝血/抗凝的平衡对及免疫功能等均具有重要意义。糖萼是血管内皮细胞内侧覆盖着的绒毛状多糖-蛋白复合结构,作为内皮细胞表层的骨架结构,强烈影响内皮细胞的功能。糖萼在血-组织通透性屏障的形成中扮演着重要角色,能够调节血细胞与内皮细胞的相互作用,为维持血管内皮细胞正常结构功能所必需。同时,糖萼在调节血管张力和抑制血管内凝血中也发挥着重要作用,生理条件下,血管内皮糖萼上结合着ATIII、HCII、TM和TFPI等抗凝血因子,使得生理条件下的内皮细胞具有抗凝特性。脓毒症本质上是过度的炎症反应和凝血紊乱。当前认为,血管内皮细胞是炎症反应的主要靶细胞之一,同时可作为一种效应细胞,在微循环障碍、脓毒性休克及多器官功能损伤中起重要作用。脓毒症时,由于LPS和炎症细胞释放的大量TNF-cuIL-6等炎症因子,内皮细胞在其刺激下发生形态及功能上的改变,大量合成释放TF,激活外源性凝血反应,同时抗凝物质表达降低。在此炎症过程中血管内皮糖萼先于内皮细胞本身,最先受到累及和破坏。对于脓毒症凝血功能障碍而言,炎症因子和LPS导致的内皮细胞损伤是凝血激活的起始,而糖萼作为内皮细胞的保护层先于内皮细胞受到破坏,成为引发后续失控的炎症反应和凝血紊乱的门户环节,理应受到重视。肝素作为经典的抗凝药物,被熟知且广泛应用。近年来还发现肝素对脓毒时的糖萼损伤有保护作用。
  
  一直以来,肝素也用于脓毒症时的抗凝治疗,但存在出血风险。HP-sp是肝素经过高碘酸氧化、硼氢化钠还原,制备得到的部分糖醛酸开环衍生物。本课题组之前的研究表明,HP-sp能够有效减轻脓毒症导致的糖萼损伤,那么可以推测,该保护作用可能有助于减轻脓毒症时的凝血障碍,发挥抗凝作用,这对于脓毒症的治疗有积极意义。因此,本课题拟以肝素作为对照,探讨HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的作用和可能的机制。
 

  药学

  本课题的主要成果有:
  
  1.肝素衍生物HP-sp的制备和体外抗凝活性研宄
  
  1.1肝素衍生物HP-sp的制备和结构确证通过对肝素进行高碘酸钠氧化和硼氢化钠还原,制得HP-sp,并对其进行1H-NMR检测。结果表明,肝素1H-NMR谱中在S3.40左右有Glc的邻二羟基的C2-C3H2,H3信号,而HP-sp的1H-NMR谱中该信号消失,与发生的反应相一致。除此之外,HP-sp的结构与肝素相比,无明显差异。
  
  1.2羊血浆法测定肝素衍生物HP-Sp的抗凝效价采用羊血浆法考察HP-sp对复钙羊血浆凝固的抑制作用,评估其体外抗凝活性。结果测得HP-sp的抗凝效价为18.4U/mg,不足肝素的10%2.肝素衍生物HP-Sp对脓毒症小鼠髙凝状态的治疗作用2.1HP-sp对脓毒症小鼠尾出血时间的影响采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠伴高凝状态模型,以肝素为对照,考察HP-sp对脓毒症小鼠凝血时间的影响。结果发现,与正常对照组比较,LPS模型组在造模5h后尾出血时间明显缩短(尸<0.05);与LPS模型组比较,肝素组和HP-sp组的尾出血时间明显延长(PC0.01);肝素组与HP-sp组相比,两组的尾出血时间无显着性差异(户>0.05)。肝素组与HP-sp组小鼠尾出血时间较正常组显着延长CP<0.05)。这表明,LPS复制的小鼠脓毒症模型呈高凝状态;肝素能发挥显着的纠正脓毒症小鼠血液高凝的作用;本课题制备的体外弱抗凝活性的HP-sp也能够显着改善脓毒症小鼠的血液高凝状态,且与肝素组无显着差异。
  
  2.2HP-sp对脓毒症小鼠血兄蠨-二聚体含量的影响采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠伴高凝状态模型,以肝素为对照,考察HP-sp对脓毒症小鼠外周血中D-二聚体(凝血功能紊乱的早期敏感指标)含量的影响。结果发现,与正常对照组比较,LPS模型组小鼠在造模5h后血浆中D-二聚体含量明显升高(P<〇。〇5);与LPS模型组比较,肝素组和HP-sp组小鼠血浆中D二聚体含量明显降低(户<0.05);肝素组与HP-sp组相比,两组的血浆中D-二聚体含量无显着性差异(P>0.05)。与正常对照组相比,肝素组和HP-sp组血浆中D-二聚体含量虽然略有升高,但无显着性差异(尸>0.05)。这表明,LPS复制的脓毒症模型小鼠血浆中D-二聚体含量显着升高,HP-sp能够显着降低脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量,其作用强度与肝素类似,二者均可使脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量降低至正常水平
  
  3.肝素衍生物HP-Sp对凝血酶的抑制作用3.1HP-sp通过ATIII对Ila的抑制活性以肝素为对照,用生色底物法在分子水平考察HP-sp通过ATIII对凝血酶活性的抑制作用。结果表明,HP-sp没有激活ATIII并灭活Ila的能力。
  
  3.2HP-sp通过HCII对凝血酶的抑制作用以肝素和硫酸皮肤素(DS)为对照,用生色底物法考察HP-sp通过HCII凝血酶活性的抑制作用。结果表明,HP-sp能激活HCII,从而抑制凝血酶。
  
  4.肝素衍生物HP-Sp对脓毒症小鼠的内皮保护作用TF、TFPI、sTM、sEPCR均与内皮细胞的结构完整性和功能状态相关,釆用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠模型,用ELISA方法测定脓毒症小鼠外周血中这四种成分的含量,考察HP-sp对脓毒症小鼠内皮损伤的保护作用。
  
  4.1HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TF含量的影响TF系脓毒症凝血激活的触发因素。结果发现,与正常组相比,LPS组小鼠血浆中TF含量明显升高,在造模后3?llh期间含量几乎没有显着变化,始终持在高水平;与LPS组相比,造模后3h,肝素组和HP-sp组的TF含量与LPS组接近,但之后呈现明显下降的趋势,7h时两组TF含量均己低于LPS组,llh时肝素组TF含量己接近正常组。这表明,肝素和HP-sp均能降低脓毒症小鼠血浆中TF含量。
  
  4.2HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TFPI含量的影响TFPI系TF的天然抑制剂,是机体生理抗凝的主要成分之一。结果发现,与正常组相比,LPS组在造模后3h,TFPI含量明显升高,而在3?llh期间,LP组TFPI含量直线下降;与LPS组相比,肝素组在3?7h期间,TFPI含量与LPS组相似,但在7?llh期间,TFPI含量明显高于LPS组,下降趋势较为平缓;与LPS组相比,HP-sp组在3?7h期间TFPI含量较低,但呈现显着升高的趋势,在7h后含量变化并不明显,但显着高于LPS组,llh时,HP-sp组含量仍高于HP组。这表明,HP和HP-sp均能使脓毒症小鼠血浆中TFPI含量升高。TFPI/TF比值的变化显示,与正常组相比,LPS组的TFPI/TF比值在3h略有升高,3?7h内基本不变,但在7?llh显着下降;与LPS组相比,3~7h内,HP组和HP-sp组比值呈现上升趋势,HP-sp组在7h时己明显高于LPS组,之后比值基本不变,而HP组始终呈现上升趋势,llh时明显高于LPS组。这表明,H和HP-sp均能使脓毒症小鼠血浆中TFPI/TF的比值明显增大。
  
  4.3HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sTM含量的影响sTM是TM脱落入血形成的,可作为内皮损伤的标志物。结果发现,与正常组相比,LPS组小鼠血浆中sTM含量明显升高,在造模后3?7h略有下降,7?llh期间含量几乎没有显着变化,始终维持在高水平;与LPS组相比,造模后3hHP组和HP-sp组含量与LPS组相似,但之后呈现下降趋势,7h时HP-sp组含量己低于LPS组,llh时二者均低于LPS组,HP-sp组含量较HP组更低。这表明,HP-sp能显着降低脓毒症小鼠血浆中sTM含量,肝素作用强度较低,主要集中在7h之后。
  
  4.4HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sEPCR含量的影响EPCR是PC/APC的高亲和力内皮细胞表面受体,脱落入血成为sEPCR,sEPCR具有抑制APC的作用,同时也可反映内皮损伤的情况。结果发现,与正常组相比,LPS组sEPCR含量明显升高,呈现先升高后下降的趋势;与LPS组相比,肝素组和HP-sp组均呈现下降趋势,3h时HP-sp组高于LPS组,7h时两组含量均低于LPS组,7?llh期间HP组含量仍明显下降,而HP-sp组含量略微下降,llh时,肝素组含量与正常组接近,HP-sp组含量与LPS组接近,HP-sp的作用不及肝素。这表明,肝素能显着降低脓毒症小鼠血浆中sEPCR含量,HP-sp在3?7h内有明显的降低其含量作用。5.结论HP-sp是肝素部分糖醛酸开环的衍生物,由于其结构中肝素抗凝戊糖结构破坏,HP-sp的体外抗凝性很弱,但仍能够显着改善脓毒症导致的小鼠高凝状态研宄发现,HP-sp抗凝作用主要依赖于其激活HCII从而灭活凝血酶;同时,HP-sp还能够通过对内皮细胞的保护,抑制脓毒症时凝血激活的起始环节,以及缓解脓毒症时对生理抗凝途径的抑制(TFPI和PC系统),从而发挥抗凝作用。本研宄为HP-sp发展成为脓毒症抗凝治疗崭新机制的药物奠定了基础。
  
  关键词:脓毒症;凝血功能障碍;内皮细胞;糖萼;肝素及衍生物;抗凝血酶III;

目录
 

  第一章前言
  

  脓毒症时血管内皮受损,导致凝血功能障碍,表现为凝血激活、生理性凝下调和纤溶抑制,糖萼在其中扮演了重要角色,因此糖萼可作为治疗脓毒症凝血功能障碍的新靶点。

  1.脓毒症凝血功能障碍

  1.1脓毒症

  
  脓毒症是感染引起的全身炎性反应综合征;由脓毒症引起的器官功能障碍或组织低灌注,为严重脓毒症;由脓毒症导致的、经过充分容量复苏后的持续低血压状态或血乳酸浓度>4mmol/L,称为脓毒症性休克。
  
  作为创伤、烧伤、感染等临床危重患者的严重并发症之一,脓毒症是多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfonctionsydrome,MODS)的前兆,也是当今危重病医学面临的重大难题。现代医学认为脓毒症的病理生理机制极其复杂,涉及感染、炎症、免疫、凝血和组织损害等一系列问题,与机体多系统、多器官的病理生理学改变有密切关系。
  
  目前普遍认为脓毒症患者病理生理学的变化与革兰阴性菌感染及其裂解产物内毒素导致的感染密切相关。细菌内毒素存在于革兰阴性菌细胞外壁上,是一种复合糖脂,又称脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),由0-多糖侧链、核心多糖和类脂A三部分构成。LPS进入体内后与血液中的脂多糖结合蛋白(LipopolysaccharideBindingProtein,LBP)结合形成LPS-LBP复合物,一方面与单核-巨噬细胞膜上的CD14结合刺激其分泌大量炎症因子,另一方面通过可溶性CD14激活损伤内皮细胞,释放出多种氧自由基和炎性介质,呈“瀑布效应”[1],引发脓毒症[2].脓毒症实质上是失控的炎症反应和凝血紊乱。脓毒症时炎性细胞和各种炎症介质的释放,激活了凝血系统。炎症反应和凝血激活相互促进、相互影响,使得凝血功能进一步恶化[3],表现为微血管内微血栓成,导致微循环障碍,进一步发展为严重脓毒症和脓毒症性休克⑷。因此,在脓毒症的治疗中,抗炎和抗凝成为两大关键点。
  
  于是人们把干预目标转向免疫炎症反应紊乱的下游,即拮抗炎症反应中损伤组织细胞的炎性介质。同时,在炎症反应的背景下,机体出现了一系列病理生理学损伤和紊乱,包括内皮细胞损伤、血液高凝和微循环紊乱等,因此治疗也应靶向这些改变目前临床上常用的治疗药物有他汀类药物、肝素(heparin,HP)、克拉霉素、乌司他丁、血必净等,其共同点是具有可靠的抗炎作用,并具有不同程度的抗凝、抗细胞凋亡和一定程度的免疫保护作用。
  
  1.2脓毒症凝血功能障碍
  
  脓毒症与凝血功能异常具有紧密联系。脓毒症凝血功能障碍是指全身广泛的凝血激活并伴随着极高的出血风险及器官功能衰竭,主要特点是血管内纤维蛋白的形成和清除的失衡,表现为凝血反应增强,抗凝血能力严重减弱,纤维蛋白溶解能力明显下降,同时伴随凝血因子与抗凝物质的大量消耗,出现弥散性血管内凝血(也3611^1^6(3丨111^&3-cularcoagulation,DIC)[6].2001年国际血栓及止血功能协会(InternationalSocietyOnthrombosisandHaemostasis,ISTH)制定了对于DIC的诊断标准[刀。根据这个标准,脓毒症患者中,有50%?70%的患者伴有凝血功能异常,其中近35%的患者达到DIC的诊断标准[8].过去的观点认为,凝血功能障碍或DIC是脓毒症晚期的并发症,后来经过大量的动物及临床研宄证实,凝血功能障碍贯穿脓毒症的整个病理过程,在其中扮演了重要角色,是脓毒症发生发展及预后的关键环节之一。许多研究表明,血管内凝血形成大量纤维蛋白,导致微血管血栓形成,进而引起广泛的器官缺血性损伤,是脓毒症时MODS的关键因素之一脓毒症常伴有DIC.有资料显示,DIC在成人脓毒症中的发生率约为20%?25%[7],而且DIC是脓毒症死亡率居高不下的重要因素之一。Kinasemints等对大量脓毒症病例汇总分析,提出炎性反应和凝血系统改变与脓毒症的严重度和病死率密切相关。有研宄者通过对童重症监护病房重患的观察发现,合并DIC的患儿并发MODS及病死率明显升高t13].DIC是最严重的凝血功能紊乱,也是脓毒症进展至MODS的重要机制之一。
  
  1.3脓毒症凝血功能障碍的发生机制
  
  脓毒症时的凝血功能障碍主要是通过凝血激活、生理抗凝机制下调及纤溶途径抑制导致的。
  
  1.3.1凝血途径激活传统理论
  
  认为凝血系统激活包括内源性和外源性两条途径,分别由XII因子和组织因子(tissuefactor,TF)激活,而且内源途径更为重要。但是,新近研宄发现早期阻断重症感染患者内源性接触途径时对凝血活化并无明显影响[14].在DIC动物模型中使用组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)、抗TF单抗或抗Vll/VIIa的单抗可以阻断凝血途径的活化,而抑制XII因子并无作用。因此,目前认为TF触发的外源性凝血途径才是脓毒症凝血激活的主要途径[15].在脓毒症模型动物实验中,利用TF抗体抑制TF活性后,发现异常凝血活动减少,纤维蛋白沉积减轻,脓毒症的死亡率也有所下降[16]
  
  脓毒症时TF主要来源于血管内皮细胞或单核细胞,而在微生物及其代谢产物、补体、细胞因子、趋化因子、急性反应时相蛋白、生长因子和凝血因子等刺激剂的作用下[17],中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和血小板也能够直接释放TF[18].TF激活循环中的VII因子并与之结合形成的TF-VIIa复合物,随后可激活X因子为Xa,Xa使凝血酶原激活为凝血酶。凝血酶激活V及VIII因子,Va又可显着增强Xa对凝血酶原转化为凝血酶的促进作用。TF-VIIa复合物也能够激活IX因子,与Villa-起发挥TF-VIIa复合物的作用,激活X因子,加速凝血酶的生成。产生的凝血酶激活XI因子,XIa又能够激活X因子,从而产生更多的凝酶。凝血酶使纤维蛋白原变为纤维蛋白单体,并激活XIII因子,使纤维蛋白单体聚集,形成稳定的纤维蛋白血凝块。同时凝血酶还能够通过激活纤溶酶原抑制物来抑制纤溶酶原活性,从而抑制纤溶过程。脓毒症中,血小板能被内毒素和炎症因子激活。活化的血小板外膜表面带负电荷,可为凝血发生提供理想载体。同时,活化的血小板可分泌凝血因子、血管活性物质、细胞因子等,如V因子、VIII因子、TF、纤维蛋白原和CD62P等[18,19],从而促进血小板凝集,使XII因子活化,启动内源性凝血途径。CD62P是血小板活化的特异性标志物,也是启动炎症反应的重要成分,介导血小板、内皮细胞之间的黏附聚集,参与凝血、血栓的形成。研究证实,脓毒症患者血浆中CD62P含量明显升高[2Q].此外,血小板的活化过程对TF、IL-6、IL-8等的合成有促进作用,其机制可能与配体CD40的释放有关m_23].
  
  1.3.2生理性抗凝机制下调
  
  抗凝作用是使凝血酶失去凝血活性,多种途径导致生理性抗凝机制的下调,是导致凝血的另一重要因素。正常机体主要有3个生理性抗凝途径:抗凝血酶III(antithrombinIII,ATIII)、蛋白C(proteinC,PC)系统和TFPI.脓毒症时上述抗凝途径均受到了明显抑制。(1)ATIIIATIII是体内最重要的生理性抗凝物质,主要由肝细胞和血管内皮细胞合成,占血浆中总抗凝血能力活性的75%[24].ATIII的主要功能是抑制凝血酶和因子Xa同时还具有其他作用:抑制血小板激活[25];调节白细胞介导的过度炎症反应;改善内皮细胞和上皮细胞的通透性,促进内皮细胞释放前列环素[26],从而抑制内毒素诱导单核细胞生成TNF-a等。ATIII是一种单链糖蛋白,其结构中具有肝素和凝血酶结合位点,是肝素依赖的丝氨酸蛋白酶抑制剂。ATIII的赖氨酸残基可与肝素结合,构型改变,使活性中心的精氨酸残基暴露,并与凝血酶、Xa、XIa、IXa、Xlla、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶结合形成1:1复合物,从而使其失活,发挥抗凝功能[27].ATIII与肝素结合后,其抗凝活性可提高2000倍,是反映体内凝血与抗凝系统激活的敏感性指标之一。脓毒症时ATIII含量下降,原因主要有:①ATIII不断结合凝血酶生成ATIII-凝血酶复合物,ATIII也与其他凝血因子形成复合物而被大量消耗,有对于DI患者的研宄可以证明这一点[28=29];②被激活的中性粒细胞所释放的弹性蛋白酶能够降解ATIII[W;③脓毒症时肝功能受损,ATIII合成减少;④脓毒症时血管通性增加,ATIII渗漏增加;⑤ATIII半衰期缩短。临床研宄表明,ATIII水平在脓毒症时下降30%[31];血浆中ATIII水平下降20%~40%,继而可引发DIC[32].另外,生理条件下,内皮细胞分泌的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)可大大增强ATIII的活性;而脓毒症时,内皮细胞分泌HS被LPS抑制[31],ATIII活性降低。(2)PC系统PC系统是调节炎症反应最有效的复杂的生理性抗凝机制[33],由PC、蛋白S(proteinS,PS)、血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)及PC抑制物构成。PC主要由肝脏合成,属于维生素K依赖性糖蛋白,以双链的酶原形式存在,本身无活性,在凝血酶作用下转化为活化蛋白C(APC)才能发挥抗凝作用。皮细胞表面的TM与凝血酶结合,一方面抑制凝血酶活性;另一方面可激活血液循环中的PC,转化为APC.TM-凝血酶复合物还能通过活化PC,抑制单核细胞产生炎症因子。APC能在钙离子与磷脂参与下,与其辅因子PS共同作用,通过蛋白水解的方式灭活凝血途径的重要因子Va和Villa.APC还能抑制Va在血小板表面的结合,抑制血小板膜上活化X因子的受体,增强ATIII与凝血酶的结合,抑制血小板活性,发挥抗凝血作用。同时,APC还能促进内皮细胞释放纤溶酶原激活(plasminogenactivator,PA),灭活纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-1),促进纤溶酶原的激活,从而激活纤溶系统。另一方面,AP通过抑制凝血酶水平来降低凝血酶激活纤溶抑制物(thrombinactivatablefibrinolysisinhibitor,TAFI)的表达,使纤维蛋白降解增多,从而发挥抗凝和促进纤溶的作用。除此之外,APC还具有重要的炎症调节作用、抗氧化作用、抗凋亡作用和保护内皮细胞屏障功能的作用[34].APC可通过与血管内皮细胞表面的活化蛋白C受体(endothelialcellproteinCreceptor,EPCR)和蛋白酶活化受体(PAR)结合,抑制凝血酶对血小板和内皮细胞的活化,抑制其诱导的炎症反应。EPCR是PC系统的重要受体之一,主位于血管内皮细胞上,属于I型跨膜蛋白。EPCR结合PC并将其呈递给TM-凝血酶复合物,能够提高PC的活化效率[35].同时,EPCR也作为APC的受体与其结合,放大APC的抗凝、抗炎活性,还能抑制内毒素诱导的单核细胞表面TF的表达,进一步发挥抗凝作用。
  
  APC还可通过拮抗核因子(NF)-kB通路活性,减少炎性因子的产生。感染时APC能够保护内皮细胞和淋巴细胞,防止细胞损伤以及损伤相关分子模式(damageassociatedmolecularpattern,DAMP)的释放。APC是脓毒症中炎症和凝血恶性循环的重要调节因子,在脓毒症和脓毒症休克出现前发生PC水平下降,是评估脓毒症预后的指标[36L严重脓毒症和脓毒症性休克时,APC的缺乏能够促进持久的炎症反应和凝血,加重器官功能障[37].据报道90%的严重脓毒症患者存在获得性PC缺乏,且PC水平的下降程度与病死率相关[38].脓毒症患者APC水平的下降可增加其死亡风险[39]
  
  PC系统在脓毒症DIC的发生中扮演重要角色。研宄表明,PC系统的抑制明显加重脓毒症DIC的严重程度并提高其死亡率,而通过使用APC来重建PC系统的功能可以防止凝血障碍的发生,改善器官功能障碍,提髙生存率[4G].脓毒症时PC系统受到抑制,可能的机制有:①PC的肝脏合成减少,消耗増加,毛细血管渗漏增加;②炎症介质如LPS、TNF-cuIL-1等可使TM和ECPR的转录受到抑制,显着降低其含量,抑制PC的激活[41];③中性粒细胞弹性蛋酶可以降解内皮细胞表面的TM,降低PC活性;④PS水平下降。游离的PS可加强APC抑制Va和Villa的能力,生理条件下,血浆中60%的PS和补体调节蛋白C4b结合蛋白(C4bBP)相结合,形成结合型PS.脓毒症时C4bBP增加,与PS结合增多,导致游离PS水平下降,APC抗凝活性显着下降。(3)TFPITFPI是TF唯一的天然抑制物,是体内最重要的外源性凝血途径特异性抑制剂。TFPI有两种同族异形体,即TFPI-1和TFPI-2,均属于丝氨酸蛋白酶抑制物Kunitz家族成员,主要由血管内皮细胞合成。体内50%~80%的TFPI通过糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)结合于内皮细胞表面,极少数以游离状态存在于循环中。TFPI对组织因子途径的抑制作用属于负反馈性质。TFPI首先与Xa结合抑制其催化活性,同时TFPI发生变构,在Ca2+的作用下与VIIa-TF复合物结合形成TF-VIIa-TFPI-Xa复合物,从而灭活TF-VIIa复合物,并保护内皮细胞的完整性。此外,TFPI能够迅速清除由TF-VIIa途径生成的凝血酶,从而发挥抗凝作用。
  
  脓毒症时凝血功能紊乱的重要原因之一即TF的增加和TFPI的相对缺乏。LPS和TNF-a能显着上调内皮细胞上TF的表达,但不增加TFPI的表达和释放,致使TFR相对缺乏,过多的TF触发凝血途径。在LPS所致脓毒症动物模型和脓毒症病人中均发现,多个器官内皮细胞表达TFPI的水平降低[42].与脓毒症时ATIII和PC的变化不同的是,脓毒症和DIC时患者体内血浆中TFPI水平轻度降低甚至升高[431虽然如此,但同时TF水平更大幅度的升高,提示是由于TFPI的相对缺乏,导致抑制TF的能力不足,最终导致凝血酶大量生成,促凝机制上调。
  
  1.3.3纤溶途径
  
  抑制凝血激活后,纤溶系统也随之激活,纤溶系统的激活以纤溶酶的产生为标志。纤溶酶是在PA的作用下由纤溶酶原(plasminogen,PLG)转变而来,可降解并消除纤维蛋白凝块。纤溶酶原主要通过组织型纤溶酶原激活物(tissueplasminogenaetivator,t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinaseplasminogenaetivator,u-PA)转变为纤溶酶,从而调控凝血。内皮细胞是t-PA的主要来源%,45:!.纤溶系统的主要抑制物是PAI-1,它是一种单链糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,主要由血管内皮细胞合成并释放进入循环,是体内重要的纤溶酶原活化抑制因子。PAI-1能分别与t-PA和u-PA结合形成1:1的复合物,使t-PA和u-PA失活,抑制纤溶酶形成,促进凝血[46,47].动物实验和临床研宄证实,脓毒症早期出现短暂的纤溶系统激活,这可能由于TNF-ouIL-1等能够引发血管内皮细胞释放储存的PA,从而发挥调节纤溶的作用。但是,随着LPS和炎症因子诱导内皮细胞合成并释放PAI-1的持续增加PA被灭活,纤溶酶生成被抑制,最终导致纤溶系统被抑制,纤维蛋白无法充分降解,造成微循环血栓的形成。
  
  动物体内体外实验均证实脓毒症时血浆中PAI-1水平显着升高[48].在脓毒症动物的多种组织中均可发现PAI-1的mRNA水平显着升高。同时,脓毒症动物肾脏、肾上腺的纤溶下调和纤维蛋白沉积与血浆中PA水平降低相关[49].脓毒症及脓毒症性休克患者表现出血浆t-PA水平下降和PAI-1水平增加,当伴随弥散性内皮损伤和凝血过程激活时,可导致DIC的发生,引起组织水肿、缺氧,器官功能障碍[5()].持续高水平的PAI-1是脓毒症病人预后不良的标志物之一[51].脓毒症患者体内PAI-1含量明显升高,主要是由于LPS和TNFa、IL-1等因子的刺激,此外还有以下因素:PAI-1作为应激急性反应蛋白被内皮细胞大释放入血;凝血酶异常增加,刺激增生血管平滑细胞合成并释放PAI-1;由于急性期血小板活性增加,血小板a颗粒释放PAI-1.脓毒症时,纤溶系统的抑制还可通过抗纤溶酶-a2与纤溶酶形成复合物后将其灭活而导致[52,53].
  
  1.4脓毒症凝血功能障碍的治疗现状
  
  随着对脓毒症凝血功能障碍的深入研宄,人们设想通过恢复脓毒症患者机体抗凝能力和纤溶能力来治疗脓毒症中的凝血紊乱。
  
  1.4.1ATIII
  
  己知ATIII水平的降低与脓毒症预后不良相关,因此,拟通过补充外源性ATIII纠正凝血紊乱。临床研宄表明,对于脓毒症合并DIC的患者,ATIII的使用能够改善DIC,甚至改善器官功能障碍。对于没有联合使用肝素的脓毒症患者,ATIII可以降低28d病死率,发挥一定的治疗作用[54].另外有临床研究显示,ATIII不能降低重度脓毒症和脓毒症性休克患者的28d病死率,反而会增加出血风险,特别是对于联合使用肝素的患者,出血风险更大[55].
  
  目前,日本在DIC的临床治疗中使用ATIII.2013年的临床试验显示,脓毒症合并DIC患者血清ATIII水平显着下降,而ATIII的使用能够明显改善DIC症状[56].20M年一项回顾性研究显示,ATIII治疗有效降低了重症肺炎所致脓毒症合并DIC患者的病死率[57].以上研究中未发现出血风险,提示ATIII具有成为毒症凝血障碍有效治疗手段的前景。
  
  1.4.2TFPI
  
  脓毒症时凝血激活由TF起始,因此使用外源性TFPI成为一种治疗脓毒症凝血功能障碍的选择。近年来,陆续开展了一系列应用TFPI治疗脓毒症的临床研究。
  
  一项对TFPI在脓毒症治疗中疗效观察的国际多中心III期临床试验主要考察了TFPI在重度脓毒症伴INR升高患者中的治疗效果,但并未获得理想结果。结果显示,TFPI对治疗总体8病死率无影响。分组分析发现NR在=的患者中TFP乎预能降低8滴死率;而30NR>啲2§、者中TFP治疗组中没有联合使素的患者81病死率明显降低,而联合使用肝素的患者病死率无显INRft的大小TFPf预均明显增加出血[财险TFP用于脓毒症的有3和出血风险仍需进一步研究。
  
  1.4.3APC
  
  基于APC在脓毒症凝血中发挥的关键作用,应用APC或PC成为一种治疗脓毒症凝血功能障碍的选择。重组人APC(rhAPC)是研宄最为广泛的抗凝药物,曾被应用于严重脓毒症患者。但是,大规模临床多中心随机临床试验研宄提示,其在严重脓毒症及脓毒症性休克中并未体现出明显效果,无法改善生存率,己于2011年退市[61].
  
  1.4.4肝素
  
  肝素是应用最早的抗凝药物,目前仍然在临床上广泛应用。有临床研宄发现肝素能够改善生存率,但与其它抗凝治疗相比,并无显着优越性。在脓毒症低风险人群中,肝素的抗凝治疗无明显获益[62,63].已有临床研宄证明,早期应用肝素可能降低重症脓毒症患者(包括脓毒症性休克、DIC患者)的死亡率,但由于应用肝素导致的大出血事件持续增多,其安全性有待于进一步考察[63,64].而且目前缺乏大型多中心的随机对照试验来验证肝素的治疗作用,同时对于有出血倾向的患者是否适合肝素治疗目前仍有争议。

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  2糖萼
  2.1糖萼的结构
  2.2糖萼的功能
  3.糖萼损伤与脓毒症凝血功能障碍
  3.1糖萼与凝血
  3.2脓毒症时糖萼的破坏
  4.糖萼为靶点的脓毒症治疗药物
  5.本课题研究思路

  第二章肝素衍生物HP-sp的制备和体外抗凝活性研究
  1实验材料
  1.1试药
  1.2实验器材
  2实验方法
  2.1肝素衍生物HP-sp的制
  2.2HP-sp的结构确证
  2.3羊血浆法测定HP-sp的抗凝效价

  3结果
  3.1HP-sp的制备
  3.2HP-sp的结构确证
  3.3羊血浆法测定HP-sp的抗凝效价
  4.讨论

  第三章肝素衍生物HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的治疗作用
  1.实验
  1.1实验动物
  1.2试药
  1.3实验器材
  2.实验方法
  2.1HP-sp对脓毒症小鼠尾出血时间的影响
  2.2HP-sp对脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量的影响
  2.3统计学分析

  3.结果
  3.1HP-sp对脓毒症小鼠尾出血时间的影响
  3.2HP-sp对脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量的影响
  4.讨论

  第四章肝素衍生物HP-sp对凝血酶的抑制作用
  1实验材料
  1.1实验动物
  1.2试药
  1.3实验器材
  2.实验方法
  2.1生色底物法测定HP-sp通过ATIII对Ila的抑制活性
  2.2生色底物法测定HP-sp通过HCII对凝血酶的抑制作用

  3结果
  3.1生色底物法测定HP-sp通过ATIII对Ila的抑制活性
  3.2生色底物法测定HP-sp通过HCII对凝血酶的抑制作用
  4讨论

  第五章肝素衍生物HP-sp对脓毒症小鼠的内皮保护作用
  1.实验材料
  1.1实验动物
  1.2试药
  1.3实验器材

  2实验方法
  2.1随机分组
  2.2药液的配制
  2.3造模及给药方案
  2.4标本采集
  2.5小鼠血浆中TF水平测定
  2.6小鼠血浆中TFPI水平测定
  2.7小鼠血浆中sTM水平测定
  2.8小鼠血浆中sEPCR水平测定
  2.9计算

  3.结果
  3.1HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TF含量的影响
  3.2HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TFPI含量的影响
  3.3HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sTM含量的影响
  3.4HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sEPCR含量的影响
  4讨论

总结

  
  凝血功能障碍贯穿脓毒症的整个病理过程,是脓毒症发生发展及预后的关键环节之一。内皮细胞在LPS和炎症因子的作用下发生一系列形态和功能的改变成为脓毒症凝血功能障碍的起始。
  
  一直以来,肝素作为经典的抗凝药物,也用于脓毒症时的抗凝治疗,但存在出血风险。本课题组前期研宄发现,肝素部分糖酸开环衍生物HP-sp能够有效减轻脓毒症导致的糖萼损伤,该保护作用可能有助于减轻脓毒症时的凝血障碍,发挥抗凝作用。基于此,本课题主要探索了HP-sp对脓毒症高凝状态的作用和可能的机制,取得的主要研究结果如下:(1)采用羊血浆法考察HP-sp对复钙羊血浆凝固的抑制作用,评估其体外抗凝活性。结果测得HP-sp的抗凝效价为18.4U/mg,不足肝素的10%.(2)采用腹腔注射LPS复制脓毒症伴高凝状态小鼠模型,考察HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的治疗作用。结果发现,HP-sp能够显着延长脓毒症小鼠尾出血时间(PC0.01);且与肝素组延长小鼠尾出血时间的作用无显着性差异(/》0.05);HP-sp能够显着降低脓毒症小鼠外周血D-二聚体含量(尸<0.05),与肝素组肝素组相比均无显着性差异(户>0.05)。
  
  (3)采用生色底物法在分子水平考察HP-sp对凝血酶的抑制作用。结果发现,HP-sp没有激活ATIII并灭活Ila的能力;但能发挥激活HCII从而拮抗凝酶的活性。(4)TF、TFPI、sTM、sEPCR均与内皮细胞的结构完整性和功能状态相关,采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠实验模型,用ELISA方法测定脓毒症小鼠周血中这四种成分的含量,考察HP-sp对脓毒症小鼠内皮损伤的保护作用。结果表明,HP-sp能够降低脓毒症小鼠血浆中TF、sTM、sEPCR的含量,升高TFPI含量,使TFPI/TF比值增大。
  
  综上,HP-sp是肝素部分糖醛酸开环的衍生物,由于其结构中肝素抗凝戊结构破坏,导致其具有极低的体外抗凝活性,但仍能够显着改善脓毒症导致的小鼠高凝状态。HP-sp抗凝作用主要依赖于其能够激活HCII从而灭活凝血酶;同时,HP-sp还能够通过对内皮细胞的保护,抑制脓毒症时凝血激活的起始环节,同时缓解脓毒症时对生理抗凝途径的抑制,从而发挥抗凝作用。
  
  本课题的创新性:
  
  (1)本课题发现肝素抗凝戊糖结构破坏后的衍生物HP-sp,仍能有效改善脓毒症小鼠的高凝状态,这有望为改善肝素在临床应用中的出血风险提供新的解决方案。(2)初步探索了肝素衍生物HP-sp的抗凝机制,即HCII依赖的凝血酶抑制,以及对内皮结构和功能的保护作用,为将HP-Sp发展成为脓毒症抗凝治疗崭新机制的药物奠定基础。今后的工作方向:(1)脓毒症时炎症反应对凝血有促进作用,HP-sp对该过程的影响有待进一步考察。
  
  (2)HP-sp对于脓毒症凝血功能障碍的其他环节,如纤溶途径等是否有影+r响,有待进一步考察。(3)HP-sp在体内的药代动力学以及最佳剂量等需要进一步研宄。
  
  (4)目前已证明HP-sp对于内皮细胞的保护作用与其能抑制水解糖萼的酶活性有关,其是否能够作为糖萼结构的类似物直接修复损伤的糖萼,有待进一步十研究。

  参考文献

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