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环境温度对斯氏按蚊繁殖功能的作用分析
发布时间:2020-02-06

  摘    要: 目的 研究环境温度对按蚊繁殖能力的影响及其分子机制。方法 在16、20、24、28、32℃5个温度梯度下进行斯氏按蚊的饲养,比较分析不同温度下斯氏按蚊的产卵能力和生存时间。并在饲血前后不同时间点提取斯氏按蚊总RNA,利用RT-qPCR的方法检测按蚊卵黄蛋白原(Vg)分子转录水平。结果 在16℃的环境温度下斯氏按蚊停止繁殖,20℃的产卵率明显低于24、28和32℃(P<0.05),其余各组间的产卵率比较则无统计学差异。在20~28℃温度范围内,随着环境温度升高斯氏按蚊的产卵时间逐渐缩短(P<0.001)、产卵数量逐渐增高(P<0.05,P<0.01)、生存时间逐渐延长(P<0.05,P<0.01);当环境温度升至32℃时,与28℃比较,斯氏按蚊的产卵时间进一步缩短(P>0.05),但产卵数量明显减少(P<0.01),且生存时间明显缩短(P<0.01)。Vg转录水平在16℃下吸血前后始终处于基础低表达水平,其他各组在吸血后24 h显着升高,各温度间转录水平有统计学差异(P<0.01),且与产卵数量差异趋势一致。结论 28℃是斯氏按蚊繁殖和生存的最佳环境温度,其分子机制可能是通过温度影响卵黄蛋白原表达水平而实现的。

  关键词: 温度; 斯氏按蚊; 繁殖能力; 卵黄蛋白原;

  Abstract: Objective To determine the effect of ambient temperature on fecundity of Anopheles stephensi and investigate its molecular mechanisms. Methods After Anopheles stephensi were divided into 5 groups, they were maintained in a mosquito cage at environment temperature of 16, 20, 24, 28 and 32 ℃, respectively. The oviposition capacity and survival time of Anopheles stephensi at different temperatures were analyzed and compared. The total RNA of Anopheles stephensi was extracted at different time points before and after blood feeding, and the transcription level of vitellogenin(Vg) was detected by RT-qPCR. Results Under the temperature of 16 ℃, Anopheles stephensi stopped reproducing. The oviposition rate was significantly lower in the 20 ℃ group than the 24, 28 and 32 ℃ groups(P<0.05). While, no such significant difference was found among the other groups. Under the range of 20~28 ℃, with the ambient temperature rising, the gravidity time was gradually shortened(P<0.001), the counts of laid eggs was gradually increased(P<0.05 or 0.01), and the survival time was gradually extended(P<0.05 or 0.01). However, when the ambient temperature rose to 32 ℃, the gravidity time was further shortened, but less eggs were laid(P<0.01) and the survival time was reduced(P<0.01), when compared with the values in the 28 ℃ group. The transcriptional level of Vg was always at low basic level before and after blood feeding under 16 ℃. Among the other temperature groups, the level was increased significantly at 24 h post blood feeding than before(P<0.01). The pattern of Vg levels among different groups was consistent with those of egg counts under the corresponding temperature. Conclusion 28 ℃ is the optimal temperature for the fecundity and survival of Anopheles stephensi. The molecular mechanism may be due to temperature affecting the expression of Vg.

  Keyword: temperature; Anopheles stephensi; fecundity; vitellogenin;

  蚊虫分布广泛,其对人类的危害除叮咬吸血骚扰人类正常生活外,作为媒介昆虫可传播疟疾、丝虫病、流行性乙型脑炎、登革热等多种疾病[1,2],每年死于蚊虫叮咬及蚊传播疾病的人数大约有72.5万人。其中,疟疾是危害人类健康最严重的蚊传疾病,主要由按蚊传播。目前,全球仍有32亿人受疟疾威胁,仅2017年就有2.19亿疟疾病例,大约43.5万例患者死于疟疾(WHO: World Malaria Report 2018)。斯氏按蚊是东南亚重要的传疟媒介,我国与东南亚国家毗邻的云南省等地也是疟疾高发区且存在斯氏按蚊的分布[3,4,5]。蚊的繁殖、生长发育、分布和种群密度及疾病传播能力等受到气候变化的影响,与环境温度、降雨量和湿度等环境因素密切相关,而气温在影响蚊的发育和疟疾流行方面起着最为重要的作用[6,7,8,9,10]。对于温度影响蚊繁殖能力的研究虽已有相关报道,但影响规律目前掌握还不够具体,且相关分子机制尚未阐明。此外,全球有近3 500种蚊,不同种的蚊虫所适应的环境温度可能存在一定差异。卵生动物的卵黄蛋白(yolk protein,YP)能够为胚胎发育提供需要的营养物质。卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)是卵生动物卵黄蛋白的前体,对作为卵生动物的按蚊的卵巢成熟及蚊卵的发育起着至关重要的作用[11,12,13,14],因此对Vg在按蚊生殖生理及种群繁殖控制中的作用机制等方面已开展了较为深入的研究[15,16,17],但对于Vg是否参与温度对蚊繁殖能力的调控尚未见报道。因此,本研究通过观察不同环境温度下斯氏按蚊繁殖能力与生存时间的差异,并通过比较分析不同温度下斯氏按蚊Vg分子转录水平,探讨环境温度对斯氏按蚊繁殖能力的影响和分子机制,为预测气候变化对蚊生长发育和种群分布的影响及蚊传疾病的预警提供理论依据和参考。

  1、 材料与方法

  1.1、 斯氏按蚊(Anopheles stephensi)

  Hor株由陆军军医大学热带医学教研室常规饲养并保种。蚊虫常规饲养条件为28 ℃,相对湿度80%,人工昼夜节律(12 h光照/12 h暗室)。幼虫喂饲酵母粉和动物肝粉脱脂混合物,成蚊喂饲10%糖水。昆明株小鼠由陆军军医大学实验动物中心提供,体质量16~20 g,雌雄不限,供3 d龄斯氏按蚊饲血。
 

环境温度对斯氏按蚊繁殖功能的作用分析
 

  1.2、 斯氏按蚊产卵能力和生存时间观察

  收集同一天羽化的斯氏按蚊,用乙醚轻麻后,将雌蚊平均分至5个蚊笼,分别置于5个不同温度的昆虫培养箱,温度设定分别为16、20、24、28、32 ℃,湿度均为80%,人工昼夜节律(12 h光照/12 h暗室),计数每笼雌蚊数,而后放入数量相当的雄蚊。10%糖水饲养至第3天,饥饿处理12 h,同时给予健康昆明株小鼠吸血2 h。饲血结束后,去除笼中雄蚊与未吸血雌蚊,将剩余饱血雌蚊进行单只饲养。杯底放入滤纸供蚊产卵,并保持湿润,杯盖为网状,每日更换糖水棉球。至每只雌蚊自然死亡前,每日观察记录其产卵时间、产卵数和死亡数,计算各组平均产卵数、产卵率以及产卵时间和生存时间。

  1.3、 斯氏按蚊Vg转录水平研究

  利用RT-qPCR方法检测不同温度下斯氏按蚊吸血前后不同时间点Vg的转录水平。

  1.3.1、 总RNA提取

  选取每个温度下蚊饲血前后4个时间点提取总RNA,分别为未饲血3 d龄成蚊,饲血后1、3和5 d。于每个时间点分别从不同温度组取10只斯氏按蚊,乙醚麻醉,去头,置于1 mL TRIzol裂解液,冰浴研磨,充分裂解,4 ℃ 14 200×g离心5 min。取上清,加氯仿200 μL,剧烈振摇15 s,室温放置15 min;4 ℃ 12 000×g离心15 min;取上层水相,加入等体积异丙醇,颠倒混匀后室温放置10 min,可见白色絮状沉淀;4 ℃ 12 000×g离心10 min,去上清,加75%乙醇1 mL,震荡数秒。4 ℃ 8 000×g离心5 min;去上清,敞口蒸干乙醇;加20~40 μL DEPC处理水溶解。

  1.3.2、 反转录合成cDNA

  每次提取总RNA后,随即进行反转录,根据反转录试剂盒的说明书进行。反转录体系为5× DNA Eraser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、总RNA 1 000 μg、RNase Free H2O补足至10 μL。42 ℃ 2 min,然后加5×PrimeSceript Buffer 4.0 μL、PrimeScript RT EnzymeMixⅠ 1.0 μL、RT Prime Mix 1.0 μL、RNase Free H2O 4.0 μL,总体积20 μL。混匀后,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。反转录合成的cDNA置于-80 ℃保存备用。

  1.3.3、 Real-time PCR

  各时期及各温度组Vg基因的转录水平变化分别以上述获取的按蚊cDNA为模板进行荧光定量PCR。以斯氏按蚊的保守基因S7作为内参基因。Vg的上下游引物序列分别为5′-AGT-CGTCCTCGTCGTCGTCTTC-3′和5′-GCGGTTCGGCTTC-TGTTCCTC-3′,S7的上下游引物序列分别为5′-ATCG-CTATGGTGTTCGGTTC-3′和5′-TCCGAGTTCATTTCCAG-CTC-3′。反应体系为cDNA模板0.5 μL、10 μmol/L Vg/S7基因的正反引物各0.4 μL、缓冲液混合物10 μL,补充ddH2O至20 μL。反应条件为95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s、60℃ 15 s、72 ℃ 30 s,共40个循环[18]。

  1.4、 统计学分析

  采用SPSS18.0统计软件和GraphPad Prism 6.0统计软件进行数据处理和绘图,各温度间产卵率比较行χ2检验,产卵数、产卵时间和死亡时间及Vg转录水平比较行t检验(符合正态分布)或Mann-Whitney检验(不符合正态分布),检验水准α=0.05。

  2 、结果

  2.1、 不同温度下斯氏按蚊繁殖能力

  在5个不同环境温度下,雌蚊的吸血率分别为37.5%、83.3%、95.0%、95.0%和85.7%,各组间两两比较,16 ℃的吸血率显着低于其他各温度组(P<0.05),其他各组间无统计学差异。

  2.1.1 、各组间产卵率比较

  16 ℃时斯氏按蚊未见产卵,说明斯氏按蚊在16 ℃环境温度下停止繁殖。20 ℃的产卵率明显低于24、28和32 ℃,差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组间的产卵率比较则无统计学差异。在16~28 ℃温度范围内,斯氏按蚊的产卵率随环境温度上升而增高,当环境温度进一步升至32 ℃时蚊产卵率则略有降低。见表1。

  表1 不同温度组间的产卵情况比较
表1 不同温度组间的产卵情况比较

  2.1.2、 各组间产卵数比较

  如图1所示,斯氏按蚊产卵数从高到低的环境温度依次是28、24、32、20和16 ℃。除16 ℃时斯氏按蚊的产卵数为0外,其他各组间两两比较,斯氏按蚊的产卵数量20 ℃显着少于24、28和32 ℃(P<0.01);24 ℃稍低于28 ℃,但无统计学差异;24 ℃和28 ℃均显着高于32 ℃(P<0.05, P<0.01)。

  图1 不同温度组间斯氏按蚊产卵数量比较
图1 不同温度组间斯氏按蚊产卵数量比较

  a: P<0.01, 与20 ℃比较; b: P<0.05, 与24 ℃比较; c: P<0.01, 与28 ℃比较

  2.1.3 、各组间产卵时间比较

  如表1所示,在20~32 ℃范围内,随环境温度升高,斯氏按蚊的产卵时间逐渐缩短。20、24、28 ℃和32 ℃ 4个温度组间的产卵时间差异有统计学意义(P<0.001)。20 ℃与24 ℃、28 ℃与32 ℃两个温度组间比较斯氏按蚊产卵时间无统计学差异,其余各组间两两比较均有统计学差异(P<0.05, P<0.01)。

  2.2、 不同温度下斯氏按蚊的生存时间比较

  各温度组间斯氏按蚊的存活情况见表2,图2。不同温度下按蚊的存活时间在16~28 ℃范围内随温度升高逐渐延长,但当环境温度升至32 ℃时按蚊生存时间则较28 ℃缩短。各组间两两比较均有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。

  表2 不同温度组间斯氏按蚊生存情况比较
表2 不同温度组间斯氏按蚊生存情况比较

  2.3、 不同温度下斯氏按蚊Vg转录水平的比较

  利用Real-time PCR技术比较分析了不同温度下斯氏按蚊吸血前1 d的3 d龄成蚊(3 d)和吸血后1、3、5 d Vg的转录水平(图3)。16 ℃在吸血前后的各时间点Vg均呈现低水平表达。其他各组在吸血前1 d斯氏按蚊Vg的表达量均为基础低表达水平;而吸血后1 d(D1)Vg表达水平均高效上调,20、24、28和32 ℃较吸血前分别提升1 700、11 500、13 750和3 800倍,4组间Vg表达量两两比较均有统计学差异(P<0.01),且各温度组间Vg的表达水平差异趋势与对应温度组的产卵数差异趋势一致;吸血后3 d(D3)4组Vg表达量骤降;吸血后5 d(D5)Vg表达量降至接近基础低表达水平。

  图2 不同温度组斯氏按蚊的生存时间比较
图2 不同温度组斯氏按蚊的生存时间比较

  图3 斯氏按蚊不同时间点各温度组Vg表达量比较
图3 斯氏按蚊不同时间点各温度组Vg表达量比较

  a: P<0.01,不同温度两两比较

  3、 讨论

  环境气候的变化不仅直接影响着人类生存的条件,也对疟疾等传染病的流行产生较大的影响。尤其是气温的改变,不仅可能改变疟疾传播媒介按蚊的分布和种群密度,也可能直接影响按蚊的传疟能力[6,7,8,9,10]。本课题组已初步阐明温度对斯氏按蚊传疟能力的影响及其相关分子机制[19],为探讨环境温度对按蚊繁殖能力的影响,本研究通过观察5个不同温度下斯氏按蚊产卵能力和生存时间的差异,发现环境温度对于按蚊繁殖能力和生存时间有着较大的影响。当温度低至16 ℃时,斯氏按蚊吸血率低且停止产卵繁殖,平均存活时间仅为3.3 d左右,提示16 ℃的环境温度不适合斯氏按蚊的繁殖生存。在20~28 ℃温度范围内随着环境温度升高,斯氏按蚊的产卵时间逐渐缩短、产卵数量逐渐增高、生存时间逐渐延长,当环境温度升至32 ℃,斯氏按蚊的产卵时间进一步缩短,产卵数量减少且生存时间缩短。综合各研究指标,提示28 ℃是斯氏按蚊繁殖和生存的最佳环境温度。

  为了进一步阐明环境温度对按蚊繁殖能力影响的分子机制,本研究利用荧光定量PCR的方法比较分析了对蚊产卵至关重要的分子Vg在不同温度下的转录水平。研究结果显示,Vg转录水平在16 ℃下吸血前后始终处于基础低表达水平,其他各温度组在吸血后24 h升高非常显着,且各温度组间的转录水平差异与产卵数量差异趋势一致,吸血后3 d骤降,吸血后5 d接近基础低水平。本研究结果提示,Vg在按蚊的产卵中起着重要的作用,且环境温度可影响按蚊Vg的转录水平。综上分析,环境温度可能通过影响卵黄蛋白原表达水平改变斯氏按蚊的繁殖能力。

  气象因素影响着蚊类的孳生和繁殖,进而影响蚊媒传染病发病以及人群健康。近年来研究发现,疟疾等蚊媒疾病在原有被消灭或控制地区存在复发风险,其呈现发病率上升、流行季节延长、流行区域扩大的趋势,这与全球气候异常、变暖导致适宜于蚊虫孳生和蚊传播疾病的环境区域扩大可能存在密切关系。关于气候对蚊传疾病流行和对蚊繁殖生存能力的影响已逐渐成为公共卫生领域关注的热点问题,相关研究报道逐渐增多[20,21,22,23,24]。然而,针对环境温度对东南亚重要传疟媒介斯氏按蚊繁殖能力及相关分子机制的研究尚未见报道。本研究将为更好地应对气候变化对蚊传疾病流行的影响和科学制定防治策略提供理论和实验依据。

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