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脑出血中过氧化物还原酶1的作用机制研究
发布时间:2020-02-06

  摘    要: 目的 探讨过氧化物还原酶1(peroxiredoxin 1,Prdx1)在中枢神经系统中的细胞定位,以及脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后Prdx1的表达变化和可能的作用机制。方法 取5只8~10周龄SD大鼠脑组织灌注,冰冻切片,免疫荧光染色比较Prdx1在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达情况。35只8~10周龄SD大鼠按随机数字表法分为sham组、ICH 12 h组、ICH 1 d组、ICH 2 d组、ICH 3 d组、ICH 4 d组、ICH 5 d组(n=5),后5组采用自体血注射法建立ICH模型,sham组予以等量生理盐水作为对照。取各组大鼠脑组织,Western blot和qRT-PCR检测各组中Prdx1 mRNA和蛋白的表达。在HeLa细胞中转染Prdx1干扰质粒或空质粒载体,分为干扰组和对照组,并对两组HeLa细胞进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),对差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行GO分析,预测Prdx1在ICH中可能的作用。结果 免疫荧光染色结果提示:在皮层,Prdx1主要分布于NeuN+的神经元,而在纹状体中,Prdx1主要分布于GFAP+的星形胶质细胞中。Western blot及qRT-PCR结果提示:Prdx1表达在ICH后3 d显着增高(P<0.05),随着时间延长,逐渐降低。RNA-seq及GO分析提示Prdx1引起的差异表达基因主要涉及在炎症反应、细胞凋亡、固有免疫反应、轴突发育等与ICH继发损伤相关的通路。结论 Prdx1在不同脑区有不同的细胞分布特点;ICH后,Prdx1升高明显,其在ICH中的可能作用机制与炎症、免疫反应、轴突发育等相关。

  关键词: 过氧化物还原酶1; 脑出血; 转录组测序;

  Abstract: Objective To investigate the cellular localization of peroxiredoxin 1(Prdx1) in the central nervous system, and its expression changes and possible mechanisms after intracerebral hemorrhage(ICH). Methods Five 8~10-week old SD rats underwent cerebral perfusion, and the brain tissue was sectioned for immunofluorescence staining to observe the localization of Prdx1 in the neurons, astrocytes and microglia. A total of 35 SD rats were randomly divided into sham group, and ICH for 12 h, and 1, 2, 3, 4 and 5 d groups(n=5). The ICH model was established by autologous blood injection in the latter 5 groups, and the sham group was treated with the same amount of normal saline as the control. The expression of Prdx1 at mRNA and protein levels in each group was detected by qRT-PCR and Western blotting. Prdx1 interference plasmid or blank vector were transfected into HeLa cells, and RNA-seq was performed to detect the differentially expressed genes(DEGs) in 2 groups of cells. GO analysis was performed on DEGs to predict the possible role of Prdx1 in ICH. Results Immunofluorescence staining showed that Prdx1 was mainly distributed in the NeuN+ neurons in the cortex, while in the striatum, Prdx1 was mainly in the astrocytes. Western blot and qRT-PCR results showed that Prdx1 significantly increased on the 3 rd day after ICH(P<0.05), and gradually decreased with elapse of time. RNA-seq and Go analysis suggested that the DEGs caused by Prdx1 were mainly involved in the inflammatory response, apoptosis, innate immune response, axon development and other pathways associated with secondary injury of ICH. Conclusion Prdx1 has different distribution characteristics in different cerebral regions. After ICH, Prdx1 is significantly elevated, and it may be associated with inflammation, immune response, and axon development in ICH.

  Keyword: peroxiredoxin 1; intracerebral hemorrhage; RNA sequencing;

  脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是脑卒中的一种类型,具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点[1]。目前针对ICH的治疗手段主要包括血肿清除及对症支持治疗等[2]。然而,MENDELOW等[3,4]临床研究显示:血肿清除并不能改善患者的预后,对症支持治疗也仅仅起到了维持生命体征的作用,对神经功能的恢复作用甚微。目前认为:ICH后功能恢复障碍的原因之一是ICH后的继发性损伤,如炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、轴突破坏等[5]。且动物实验表明[6,7]:减轻ICH后的继发损伤,可以显着改善ICH后的症状。因此,针对ICH的继发性损伤的研究是ICH治疗的主要方向之一。Prdx1是一类过氧化物酶[8],已有研究表明Prdx1通过减少氧自由基的产生,还原被氧化的蛋白等方式[9],抑制机体在病理状态下的氧化应激反应,减轻炎症反应和细胞凋亡[10,11],而这些病理过程均与ICH后的继发性损伤相关。但是对于Prdx1在ICH后的表达变化及作用研究甚少。因此,本研究通过探讨Prdx1在ICH中的表达变化及可能发挥的作用,为ICH的治疗提供新的分子靶点。

  1、 材料与方法

  1.1 、实验动物及分组

  40只8~10周的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,购于陆军军医大学动物实验中心,将动物置于标准饲养条件下饲养7 d。所有大鼠维持在(25±2)℃的恒温动物房中。12 h光照/12 h暗环境,食物和水充足。其中5只用于免疫荧光染色,35只按随机数字表法分为sham组、ICH 12 h组、ICH 1 d 组、ICH 2 d 组、ICH 3 d组、ICH 4 d组、ICH 5 d组(n=5)。
 

脑出血中过氧化物还原酶1的作用机制研究
 

  1.2、 主要试剂

  抗NeuN抗体、抗Ibα1抗体、抗GFAP抗体及抗Prdx1抗体均购于英国Abcam公司;抗β-actin抗体购于美国Santa公司,荧光二抗Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、防荧光淬灭封片剂及TRIzol购于美国Invitrogen公司,DAPI购于广州Wellbio公司,蛋白磷酸酶抑制剂购于瑞士Roche公司,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶购于上海碧云天公司,辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗Goat-Anti-Mouse、Goat-Anti-Rabbit购于北京中杉金桥公司,SuperECL Plus购于美国Thermo公司,硝化纤维素膜购于德国默克公司,RNA逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司,PCR引物购于上海生工公司,Prdx1干扰质粒由武汉生命之美公司提供。

  1.3 、方法

  1.3.1、 ICH模型建立

  SD大鼠ICH模型建立过程参见文献[12]:70 μL无抗凝剂的自体血或等体积的生理盐水,用注射泵以10 μL/min的速度注射于右侧纹状体(以Bregma为原点,向前0.2 mm,向左3.5 mm, 深度为5.5 mm),注射完毕后留针10 min,缓慢拔针,缝合头部皮肤。模型建立的成功率达95%,在建模过程中死亡及失败的模型不包含在实验中。

  1.3.2、 免疫荧光染色

  参见文献[13]方法:用4%的多聚甲醛灌注固定大鼠脑组织,梯度脱水后,进行包埋,用冰冻切片机(徕卡公司,德国)切成30 μm厚的组织切片,切片用0.5%的Triton-X 37 ℃通透1 h,5%的BSA 37 ℃封闭2 h,一抗NeuN(1∶200), GFAP(1∶200),Ibα1(1∶200)分别与Prdx1(1∶200)共染,4 ℃孵育过夜,PBS漂洗后,37 ℃孵育荧光二抗1 h,荧光二抗包括Alexa Fluor 647(1∶500), Alexa Fluor 488(1∶500),PBS漂洗后,DAPI复染细胞核10 min,PBS漂洗,防淬灭封片剂封片后,在共聚焦显微镜下观察(徕卡,德国),记录阳性细胞并计算平均值。

  1.3.3、 Western blot

  参见文献[14]方法:在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中分离30 μg蛋白质溶解物,转移到硝化纤维素膜上。在室温条件下,用5% BSA进行封闭。在4 ℃条件下孵育一抗过夜。实验中主要用到的一抗有Prdx1(1∶1 000), β-actin(1∶1 000)。用TBST洗去一抗,室温下与辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗孵育2 h。TBST清洗后,根据制造商的说明,利用化学发光系统检测蛋白的表达,并用image J计算灰度值。

  1.3.4、 RNA提取及qRT-PCR

  用TRIzol提取组织和细胞中的RNA,并利用逆转录试剂盒进行逆转录,在实时荧光定量PCR设备(ABI公司,美国)上进行检测,相关基因的表达水平用2-△△CT进行计算[15]。涉及的引物序列:大鼠GAPDH 正向5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,反向5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′;大鼠Prdx1 正向5′-CGCACCATTGCTCAGGAT-3′,反向5′-AGCGGCCAACAGGAAGAT-3′;人GAPDH 正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′;人CARD11正向 5′-AATGACAGCGGCGGGTTTGAC-3′,反向5′-TGGTGGGAGGAGGAGGAGGAG-3′;人 C3AR1 正向 5′-AGATGCAGCGGACAGTGAACAC-3′,反向5′-GCCAAGTGAGCCAGCGAGAAG-3′。

  1.3.5、 转录组测序及数据分析

  收集野生型HeLa细胞(对照组)和Prdx1干扰的HeLa细胞(干扰组),每组样本收集5 μg RNA进行ployA库建设,对片段为300~500 bp的产物进行测序,并利用edgeR软件检测样本间差异表达的基因,对差异表达的基因进行GO分析。

  1.4 、统计学分析

  利用SPSS 20.0统计软件,数据以x ? ±s

  x?±s

  表示,两样本之间采用独立样本t检验,多样本之间采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

  2、 结果

  2.1 、Prdx1在大鼠大脑中的细胞定位区域差异性

  Prdx1与NeuN,Ibα1和GFAP免疫荧光共染色结果表明:在皮层,Prdx1主要表达在NeuN+的神经元,Ibα1+的小胶质细胞和GFAP+的星形胶质细胞中仅少量表达(图1);而在纹状体,Prdx1主要表达在GFAP+的星形胶质细胞,少量表达于Ibα1+的小胶质细胞,而在NeuN+的神经元中不表达(图2)。

  2.2、 Prdx1在ICH后的表达变化

  qRT-PCR和Western blot检测结果显示:ICH后,Prdx1 mRNA水平从12 h开始上升,在ICH第3天时达到高峰,随后开始降低(P<0.01, P<0.05,图3A)。而蛋白水平在ICH后12 h虽差异无统计学意义,但有降低的趋势,2 d后蛋白水平开始升高(P<0.05,图3B)。

  图1 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠皮层的分布
图1 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠皮层的分布

  图2 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠纹状体的分布
图2 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠纹状体的分布

  2.3、 Prdx1影响炎症、固有免疫反应及突触发育相关基因的表达

  RNA-seq结果表明:Prdx1降低后,共有671个基因发生了差异性表达,其中289个基因高表达,382个基因低表达(图4A)。对差异表达的基因进行GO分析, 结果提示:差异表达的基因集中在炎症反应、细胞凋亡、固有免疫反应及轴突发育等(图4B、D)。对相关差异表达基因进行验证,得到了与RNA-seq类似的变化趋势(P<0.05,P<0.01,图4C)。

  图3 Prdx1在ICH后的不同时间点变化趋势 (n=5)
图3 Prdx1在ICH后的不同时间点变化趋势 (n=5)

  A:qRT-PCR检测Prdx1在ICH后12 h和1、2、3、4、5 d的mRNA水平 a: P<0.01, b: P<0.05,与sham组比较;B:Western blot检测Prdx1在ICH后12 h和1、2、3、4、5 d的蛋白水平

  图4 Prdx1干扰后的差异表达基因及GO分析
图4 Prdx1干扰后的差异表达基因及GO分析

  A:差异表达基因火山图 黑点表示无差异表达基因,蓝点表示下调表达基因,红点表示上调表达基因;B:下调表达基因的GO分析;C:对照组和Prdx1干扰组HeLa细胞相关基因的mRNA水平(n=3) a:P<0.05, b: P<0.01, 与对照组比较;D: 上调表达基因的GO分析

  3、 讨论

  ICH的继发性损伤是引起患者功能恢复障碍的主要原因之一,因此减轻继发性损伤是ICH治疗的有效靶点。既往的研究提示:过氧化物酶Prdx1可以减轻炎症反应、氧化应激等病理过程,而这些病理过程均参与ICH后的继发性损伤,但是Prdx1在ICH中的研究甚少。LIU等[16]报道:ICH后Prdx1表达增强,且TLR4/NF-κB信号通路激活,推测ICH后增高的Prdx1激活TLR4/NF-κB信号通路,从而加重ICH后的继发性损伤。但该研究缺乏Prdx1与TLR4/NF-κB相互作用的证据及Prdx1过表达或干扰后在ICH中效应,并没有完全阐明Prdx1在ICH的作用及机制。为了进一步明确Prdx1在ICH中的表达变化和可能作用机制,我们进行了该课题的研究。

  首先,本研究发现Prdx1在中枢神经系统不同区域的细胞定位存在差异性。NAKASO等[17]研究显示:Prdx1主要在星形胶质细胞中表达,而本研究实验结果显示:Prdx1既表达于神经元,也表达于星形胶质细胞,且与区域相关;在纹状体区,其主要表达于星形胶质细胞,而在皮层区域,Prdx1主要表达于神经元。这种分布的差异性提示Prdx1功能的多样性。YAN等[18]研究发现:分布于神经元中的Prdx1通过与GDE2相互作用,驱动神经元分化。而分布于胶质细胞中的Prdx1主要通过抑制ROS及炎症等方式减轻中枢神经系统中的炎症反应。结合既往研究,我们猜想:ICH后神经元中的Prdx1可能通过促进前体细胞分化补充受损神经元,而星形胶质细胞中的Prdx1可能通过减轻ICH后的炎症反应及细胞凋亡等方式减轻ICH后的继发性损伤。位于神经元和星形胶质细胞中的Prdx1是否在ICH后发挥不同的作用,仍需进一步研究。

  本研究显示:ICH后,Prdx1 mRNA水平从12 h开始增高,3 d时达到高峰,随之下降,而蛋白水平在12 h有降低的趋势,2 d开始升高,4 d达到高峰。这种蛋白和mRNA水平的不一致性可能与蛋白消耗性降低或蛋白合成的迟滞相关。NAKASO 等[17]研究显示:Prdx1的蛋白水平在ICH后1 d时就高于sham组,造成与本研究结果差异性的原因可能与动物品种、建模方式等相关。同时,血肿周围组织的免疫荧光染色结果显示,ICH后,升高的Prdx1主要表达于星形胶质细胞,与既往的报道一致[17]。

  最后,本研究通过转染Prdx1干扰质粒建立Prdx1低表达的HeLa细胞模型,与野生型HeLa细胞相比,Prdx1干扰后导致炎症反应、细胞凋亡、固有免疫反应和轴突发育等相关的分子差异性表达,这些结果表明:Prdx1在ICH中发挥作用可能与上述相关的病理过程有关。同时对相关的基因如C3AR1、CARD11等进行验证,结果提示Prdx1干扰后可以显着下调C3AR1、CARD11的表达。既往的研究表明:C3AR1参与脑损伤后的轴突修复及神经保护作用[19],且通过其下游分子PTEN减轻脑损伤后的炎症反应等[20],而CARD11对Treg细胞发挥功能是必不可少的[21]。因此我们推测:Prdx1在ICH中,可能通过影响C3AR1、CARD11等基因的表达,促进ICH后的轴突修复、减轻炎症反应及促进Treg细胞活化,从而减轻ICH后的继发损伤。但Prdx1通过怎样的机制作用于C3AR1、CARD11,从而引起其差异性表达仍需进一步研究。

  综上所述,本研究结合体内实验及转录组测序等技术,明确了Prdx1在中枢神经系统的细胞定位及该分子在ICH后的表达变化,并预测了其在ICH中可能的作用机制,为ICH的治疗提供了新的靶点。

  参考文献

  [1]KRISHNAMURTHI R V,FEIGIN V L,FOROUZANFAR M H,et al.Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010:findings from the global burden of disease study 2010[J].Lancet Glob Health,2013,1(5):e259-e281.DOI:10.1016/S2214-109X(13)70089-5.
  [2]KEEP R F,HUA Y,XI G H.Intracerebral haemorrhage:mechanisms of injury and therapeutic targets[J].Lancet Neurol,2012,11(8):720-731.DOI:10.1016/S1474-4422(12)70104-7.
  [3]MENDELOW A D,GREGSON B A,FERNANDES H M,et al.Early surgery versus initial conservative treatment in patients with spontaneous supratentorial intracerebral haematomas in the International Surgical Trial in Intracerebral Haemorrhage (STICH):a randomised trial[J].Lancet,2005,365(9457):387-397.DOI:10.1016/S0140-6736(05)17826-X.
  [4]MENDELOW A D,GREGSON B A,ROWAN E N,et al.Early surgery versus initial conservative treatment in patients with spontaneous supratentorial lobar intracerebral haematomas (STICH II):a randomised trial[J].Lancet,2013,382(9890):397-408.DOI:10.1016/S0140-6736(13)60986-1.
  [5]ZHENG H P,CHEN C L,ZHANG J,et al.Mechanism and therapy of brain edema after intracerebral hemorrhage[J].Cerebrovasc Dis,2016,42(3/4):155-169.DOI:10.1159/000445170.
  [6]HU L T,ZHANG H Y,WANG B Y,et al.MicroRNA-23b alleviates neuroinflammation and brain injury in intracerebral hemorrhage by targeting inositol polyphosphate multikinase[J].Int Immunopharmacol,2019,76:105887.DOI:10.1016/j.intimp.2019.105887.
  [7]LAI X,XIONG Y,ZHOU J,et al.Verbascoside attenuates acute inflammatory injury in experimental cerebral hemorrhage by suppressing TLR4[J].Biochem Biophys Res Commun,2019,519(4):721-726.DOI:10.1016/j.bbrc.2019.09.057.
  [8]SHICHITA T,HASEGAWA E,KIMURA A,et al.Peroxiredoxin family proteins are key initiators of post-ischemic inflammation in the brain[J].Nat Med,2012,18(6):911-917.DOI:10.1038/nm.2749.
  [9]YAMAGUCHI M,SATO H,BANNAI S.Induction of stress proteins in mouse peritoneal macrophages by oxidized low-density lipoprotein[J].Biochem Biophys Res Commun,1993,193(3):1198-1201.DOI:10.1006/bbrc.1993.1752.
  [10]MIN Y,KIM M J,LEE S,et al.Inhibition of TRAF6 ubiquitin-ligase activity by PRDX1 leads to inhibition of NFKB activation and autophagy activation[J].Autophagy,2018,14(8):1347-1358.DOI:10.1080/15548627.2018.1474995.
  [11]LIU W,GUO W J,ZHU Y C,et al.Targeting peroxiredoxin 1 by a curcumin analogue,AI-44,inhibits NLRP3 inflammasome activation and attenuates lipopolysaccharide-induced Sepsis in mice[J].J Immunol,2018,201(8):2403-2413.DOI:10.4049/jimmunol.1700796.
  [12]XU H,CAO J,XU J G,et al.GATA-4 regulates neuronal apoptosis after intracerebral hemorrhage via the NF-κB/Bax/Caspase-3 pathway both in vivo and in vitro[J].Exp Neurol,2019,315:21-31.DOI:10.1016/j.expneurol.2019.01.018.
  [13]XIONG X Y,LIU L,WANG F X,et al.Toll-like receptor 4/MyD88-mediated signaling of hepcidin expression causing brain iron accumulation,oxidative injury,and cognitive impairment after intracerebral hemorrhage[J].Circulation,2016,134(14):1025-1038.DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.116.021881.
  [14]WANG Y C,ZHOU Y,FANG H,et al.Toll-like receptor 2/4 heterodimer mediates inflammatory injury in intracerebral hemorrhage[J].Ann Neurol,2014,75(6):876-889.DOI:10.1002/ana.24159.
  [15]MENG Z Y,ZHAO T,ZHOU K,et al.A20 ameliorates intracerebral hemorrhage-induced inflammatory injury by regulating TRAF6 polyubiquitination[J].J Immunol,2017,198(2):820-831.DOI:10.4049/jimmunol.1600334.
  [16]LIU D L,ZHAO L X,ZHANG S,et al.Peroxiredoxin 1-mediated activation of TLR4/NF-κB pathway contributes to neuroinflammatory injury in intracerebral hemorrhage[J].Int Immunopharmacol,2016,41:82-89.DOI:10.1016/j.intimp.2016.10.025.
  [17]NAKASO K,KITAYAMA M,MIZUTA E,et al.Co-induction of heme oxygenase-1 and peroxiredoxin I in astrocytes and microglia around hemorrhagic region in the rat brain[J].Neurosci Lett,2000,293(1):49-52.DOI:10.1016/s034-3940(00)01491-9.
  [18]YAN Y,SABHARWAL P,RAO M,et al.The antioxidant enzyme Prdx1 controls neuronal differentiation by thiol-redox-dependent activation of GDE2[J].Cell,2009,138(6):1209-1221.DOI:10.1016/j.cell.2009.06.042.
  [19]JAUNEAU A C,ISCHENKO A,CHATAGNER A,et al.Interleukin-1beta and anaphylatoxins exert a synergistic effect on NGF expression by astrocytes[J].J Neuroinflamm,2006,3:8.DOI:10.1186/1742-2094-3-8.
  [20]BRENNAN F H,JOGIA T,GILLESPIE E R,et al.Complement receptor C3aR1 controls neutrophil mobilization following spinal cord injury through physiological antagonism of CXCR2[J].JCI Insight,2019,4(9):98254.DOI:10.1172/jci.insight.98254
  [21]POLICHENI A,HORIKAWA K,MILLA L,et al.CARD11 is dispensable for homeostatic responses and suppressive activity of peripherally induced FOXP3+regulatory T cells[J].Immunol Cell Biol,2019,97(8):740-752.DOI:10.1111/imcb.12268.

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