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双扩增法RNA恒温扩增技术的性能分析
发布时间:2021-11-16

  摘    要: 目的 对双扩增法RNA恒温扩增技术进行方法学性能评价。方法 选取2020年5—9月因呼吸道感染就诊于上海中医药大学附属第七人民医院患者的咽拭子标本40例(含经聚合酶链反应荧光探针法判定的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体7种病原体阳性标本各5例,阴性标本5例),通过检测对比评价双扩增法检测7种常见呼吸道病原体RNA的准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性能力。结果 对已知结果的40例呼吸道咽拭子标本进行7种病原体双扩增法检测,检测结果与原诊断结果一致,准确性100%;对稀释后的LOD1、LOD2和LOD3 3个梯度的灵敏度样品进行检测,各病原体灵敏度验证结果符合要求; 7例病原体阳性标本和1例阴性标本每天分别重复检测3次,连续重复检测5 d,与原诊断结果一致,符合率100%; 7种病原体之间及7种病原体与其他多种病原体之间无交叉反应; 2 g/L的血红蛋白和1%(W/V)的黏蛋白对病原体检测结果无干扰。结论 双扩增法检测RNA的准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性能力均符合要求,具有准确、速度快、通量高等优点,是临床实验室病原体测定的可靠方法。

  关键词 :     呼吸道病原体;双扩增法; RNA恒温扩增;方法学评价;

  Abstract: Objective To evaluate the performance of dual amplification technology( DAT) for the detection of respiratory pathogens RNA. Methods From May to September 2020,40 throat swab samples of patients with respiratory tract infection in Seventh People' s Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine were selected( including 5 positive samples each of influenza A virus,influenza B virus,respiratory syncytial virus,parainfluenza virus,adenovirus,mycoplasma pneumoniae,chlamydia pneumoniae and 5 negative samples determined by polymerase chain reaction fluorescence probe method). The accuracy, sensitivity,reproducibility,cross-reaction and anti-interference ability of DAT for detecting RNA of seven common respiratory pathogens were evaluated by detection and comparison. Results Forty throat swabs samples with known results were detected by seven respiratory pathogens DAT,and the results were 100% consistent with the original diagnosis.The sensitivities of diluted LOD1,LOD2 and LOD3 samples were tested,and the sensitivity validation results meet the requirement. Seven cases of positive pathogen samples and 1 case of negative pathogen sample were repeatedly detected for 5 d continuously,3 times/d,and the result was consistent with the original diagnosis,with 100%coincidence rate. There were no cross-reactions among 7 pathogens or among those and other pathogens. The 2 g/L hemoglobin and 1%( W/V) mucin did not interfere the detection results of pathogens. Conclusions DAT is the reliable method for pathogen detection in clinical laboratory. The accuracy,sensitivity,repeatability,cross-reaction and anti-interference ability of DAT RNA detection meet the requirements,and it has the advantages of accuracy,high speed and high flux.

  Keyword: Respiratory pathogens; Dual amplification technology; Isothermal amplification of RNA; Methodological evaluation;

  急性呼吸道感染是婴幼儿、老人及免疫力低下人群常见病和多发病,具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点。肺炎是5岁以下儿童死亡的主要原因[1],下呼吸道感染是80岁及以上老年患者死亡的首位原因[2]。急性呼吸道感染可由细菌、病毒、支原体、衣原体等多种微生物引起[3],不同病原体感染后临床症状相似,且存在一定比例混合感染[4],临床难以凭借经验明确致病原,因此全面、早期、快速、精准的呼吸道病原学鉴别诊断对临床治疗至关重要。鉴别诊断呼吸道病原体的方法有很多[5,6],其中分离培养是病原体鉴定的“金标准”,准确性高,但操作复杂且耗时长,难以满足临床快速诊断的需求。基于免疫学方法的抗原或者抗体检测,其中抗原检测灵敏度不足,易漏检[7];抗体检测方法窗口期长,难以实现早期诊断,且抗体产生后在体内存在时间长达2~3个月,不能很好地区分既往感染和急性感染[7,8,9]。随着检验技术的发展,分子诊断技术因其较高的诊断特异敏感性的优点,被逐渐应用于临床早期诊断[10]。呼吸道感染性疾病常有多病原混合感染发生,因此单个病原体的荧光聚合酶链反应(PCR)检测已经不能满足临床检测需求。此外,荧光PCR需要不断变温扩增,热循环仪是不可或缺的设备。热循环仪体积大、价格高,应用于现场检测和在基层的推广受到了极大的限制[11,12]。近年来,恒温扩增技术因其是在单一温度下对靶序列进行扩增或信号放大,不依赖便携性差、价格昂贵的热循环仪,检测时间短等特点越来越多地应用于临床病原微生物检测及实时现场检测与监测[11,12,13,14]。双扩增法就是一种RNA恒温扩增多重检测技术,以病原体复制过程中的转录RNA为扩增靶标,一次采样一次实验,同时实现甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV) 1/2/3、腺病毒B/E、肺炎支原体(MP)和肺炎衣原体(CP) 7种病原体的快速检测。本研究将从准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性实验等多个方面来评估双扩增法的检测性能,以便于临床实验室选择和开展应用。
 

双扩增法RNA恒温扩增技术的性能分析
 

  1 、材料与方法

  1.1 、标本

  实验标本来源于2020年5—9月因呼吸道感染于上海中医药大学附属第七人民医院就诊患者的咽拭子标本,其中FluA、FluB、RSV、PIV、腺病毒、MP和CP阳性临床标本和阴性标本各5例,共40例(经PCR荧光探针法判定)。本研究方案通过上海中医药大学附属第七人民医院伦理委员会批准(20210129)。

  1.2 、评价试剂

  武汉中帜生物科技股份有限公司7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法),批号:301200201;试剂盒含人源性内标,可实现对标本采集及扩增检测等全程质量控制,避免由于采样或操作不当造成的假阴性。

  1.3 、灵敏度测试样品

  购买自美国模式菌种收集中心的FluA、Flu B、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP病原体,去RNA酶水稀释后混合成3个梯度的灵敏度样品(LOD1、LOD2、LOD3),混合后浓度与各病原体灵敏度样品滴度表一致,其中LOD2是7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)说明书中标识的最低检测限。

  1.4、 交叉反应样品

  购买自美国模式菌种收集中心的人冠状病毒(COV)、肠道病毒71型(EV71)、肺炎链球菌(SP)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、流感嗜血杆菌(HI),浓度分别为6.2×109、5.62×109TCID50/L和1.50×108、1.50×1012、6.8×109cfu/L,用于交叉反应实验。

  1.5 、实验仪器

  该实验所用到的仪器是迷你金属浴(Mini G-R100)[莱普特科学仪器(北京)有限公司]及全自动化学发光免疫分析仪(ADC CLIA 200)(烟台艾德康生物科技有限公司),其中迷你金属浴可完成RNA恒温扩增检测,全自动化学发光免疫分析仪为双扩增法定制仪器,可满足基于双扩增法平台所有检测试剂盒产品的核酸杂交检测。

  1.6、 相关方法

  1.6.1、 双扩增法的检测原理

  双扩增法检测咽拭子采集的细胞中的7种呼吸道病原体RNA。样本中的细胞经细胞裂解液裂解后,释放病原体核酸,然后在逆转录酶和T7 RNA聚合酶的作用下,经过逆转录和转录过程,实现病原体的T7核酸扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有捕获探针的微孔中进行杂交,同时加入该捕获探针对应的特异探针。微孔中的捕获探针可与RNA产物结合使其锚定到微孔中;特异探针的一端可结合到RNA产物上,另一端与下一步加入的放大探针结合,实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶联物结合,最终形成捕获探针-RNA扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶联物复合体,最后加入辣根过氧化物酶化学发光底物,在化学发光仪上进行检测。该方法将人内源基因18SrRNA作为内质控,与病原体靶标同时进行扩增检测,通过对内质控阴阳性结果的判断实现检测质量控制。

  1.6.2 、操作方法

  仪器按照使用说明提前进行校准,然后按照7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)说明书完成咽拭子标本及灵敏度样品的准确性、灵敏度、重复性、交叉感染及抗干扰实验。

  1.6.3、 评价相关实验

  准确性实验:对已知结果的40例呼吸道咽拭子标本(Flu A、FluB、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP阳性的标本各5例,阴性标本5例)用7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)按照标准操作规程进行检测,查看检出情况。灵敏度实验:对稀释后的LOD1、LOD2和LOD3 3个梯度的灵敏度样品用7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)按照标准操作规程进行检测1次,查看检出情况。重复性实验:选择FluA、FluB、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP阳性标本及阴性标本各1例,共计8例标本,进行重复性实验。8例标本每天分别重复检测3次,连续重复检测5 d,查看检出情况。交叉反应实验:在7种病原体混合样品LOD1以及阴性标本中均加入COV、EV71、SP、S.aureus、HI后进行检测,查看检出情况。抗干扰实验:随机挑选Flu A、Flu B、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP阳性标本各1例和阴性标本1例,加入一定浓度的黏蛋白和血红蛋白,制成2 g/L的血红蛋白和1%(W/V)的黏蛋白标本,重复检测3次,验证抗干扰能力。

  2 、结果

  2.1 、准确性实验

  对已知结果的40例呼吸道咽拭子标本用7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)进行检测。其中,FluA、FluB、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP指标阳性的标本各5例,共35例;7种病原体全部阴性的标本5例。双扩增法测定结果与原诊断结果100%一致。

  2.2、 灵敏度实验

  对稀释后的LOD1、LOD2、LOD33个梯度的灵敏度样品进行检测1次。其中,LOD1梯度测试检出率100%,LOD2梯度测试检出率100%,LOD3梯度测试检出率83.33%,灵敏度验证结果符合要求。

  2.3、 重复性实验

  选择FluA、Flu B、RSV、PIV、腺病毒、MP、CP阳性标本及阴性标本各1例,共计8例标本,进行重复性实验。8例标本每天分别重复检测3次,连续重复检测5 d,与原诊断结果一致,符合率100%。

  2.4 、交叉反应实验

  在7种病原体混合样品LOD1以及阴性标本中均加入COV、EV71、SP、S.aureus、HI后进行检测。其中,LOD1样品检测结果为7种呼吸道病原体相互之间不受干扰,全部检出阳性,COV、EV71、SP、S.aureus、HI均为阴性;阴性标本检测结果为阴性。因此,7种呼吸道病原体之间及与其他多种病原体之间无交叉反应。见表1。

  表1 双扩增法检测呼吸道病原体RNA性能评价的交叉反应实验结果
表1 双扩增法检测呼吸道病原体RNA性能评价的交叉反应实验结果

  注:Flu A为甲型流感病毒;Flu B为乙型流感病毒;RSV为呼吸道合胞病毒;PIV为副流感病毒;MP为肺炎支原体;CP为肺炎衣原体

  2.5、 抗干扰实验

  咽拭子标本中可能存在潜在的干扰物质,主要包括血液、咽部分泌物等。抗干扰实验结果表明,2 g/L的血红蛋白和1%(W/V)的黏蛋白对病原体检测结果无干扰。见表2。

  3 、讨论

  一种检测方法是否具备良好的性能主要体现在几个方面:(1)具有良好的检测准确性,灵敏度高,特异性强;(2)能够满足临床快速检测、早期诊断、标本采集简单且用量少、安全等多种需求;(3)比常规方法学具有一定优势。为了保证检验质量,临床实验室在使用新的分析方法进行患者标本检测前,必须在新的实验环境中通过实验来评价它的基本性能以及优化检验流程,以保障实验室检验质量。

  表2 双扩增法检测呼吸道病原体RNA性能评价的抗干扰实验结果
表2 双扩增法检测呼吸道病原体RNA性能评价的抗干扰实验结果

  注:Flu A为甲型流感病毒;Flu B为乙型流感病毒;RSV为呼吸道合胞病毒;PIV为副流感病毒;MP为肺炎支原体;CP为肺炎衣原体;“-”为阴性标本

  上述研究结果显示,40例临床确诊标本用双扩增法检测7种呼吸道病原体核酸准确性为100%;对3个梯度的灵敏度样品进行检测,各病原体灵敏度验证结果符合验证要求;连续5 d,每天3次的重复性实验与临床确诊结果符合率为100%;7种呼吸道病原体之间及7种病原体与其他多种病原体之间无交叉反应;2 g/L的血红蛋白和1%(W/V)的黏蛋白对病原体检测结果无干扰。通过以上性能验证结果可以看出,双扩增法检测7种常见呼吸道病原体准确性、重复性、灵敏度、抗交叉反应及抗干扰能力良好。

  同时,有研究表明,双扩增法具有较高的敏感性和特异性,检测能力与荧光PCR相当[15];双扩增法较抗原检测方法学更为灵敏,具有更高检出率,43例急性呼吸道感染患者标本双扩增法阳性检出率为33.3%,相比直接免疫荧光法高出11.1%[16]。因此,可以看出双扩增法的准确性、灵敏度良好。

  双扩增法采用人内源基因18SrRNA作为内质控,可实现从标本采集、保存、运输到实验操作及结果测定全程质控。咽拭子采集质量一直是影响检测结果的关键性影响因素之一,而人源基因内质控检出阳性,意味着采集到了呼吸道脱落细胞,进而有效避免由于咽拭子采集质量而造成的假阴性结果。从本性能验证结果中也可以看出,纳入研究的咽拭子标本18SrRNA均为阳性,说明实验用咽拭子标本质量符合要求,无假阴性结果。在实际临床检验中,可通过18SrRNA结果的阴阳性辅助评估标本采集质量,避免由于标本采集不合格或者标本保存不当RNA降解所造成的假阴性结果。

  从技术操作层面来分析,双扩增法无需核酸提取,室温一步法直接细胞裂解即可对释放出的RNA分子进行检测,操作更为简便、降低提取成本,缩短标本处理时间,提高标本批处理效率。配套定制化学发光分析仪进行检测,相较于其他方法学具有自动化程度高、操作更为简便、检测速度快、检测通量高等优点。

  之所以对双扩增法进行评价,是因为双扩增法是一种创新RNA多重检测技术,针对性检测呼吸道病原体RNA为病原体复制繁殖过程中所产生的转录RNA进行检测,具有早期诊断,提示现症感染的临床价值,这点在Christensen等[17]和Ko等[18]的研究中也有体现,研究指出偏肺病毒和腺病毒这类DNA病毒应该选择mRNA作为病毒诊断靶标,而不是DNA。此外,《儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识》[19]中也明确指出,由于RNA随病原体死亡而降解,可作为评价MP感染转归、药物疗效的指标,其检测结果与MP的感染严重程度相关性较好,因此MP的RNA检测是目前早期快速诊断、判断疗效的最好方法之一,分子生物学RNA检测方法也作为MP检测一级方法学推荐。此外,双扩增法扩增产物为RNA,相较于PCR的DNA扩增产物,不易造成环境污染。此次研究仅为对双扩增法的准确性等性能的初级评价,DNA病毒及细菌的RNA检测现症感染的特性还需进行深入研究分析以进一步对双扩增法进行评估。

  综上所述,双扩增法检测RNA的准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性能力均性能良好符合要求,可针对临床常见的7种呼吸道病原体RNA进行早期、多重鉴别诊断,不仅为临床诊疗提供可靠依据,还可避免抗菌药物的滥用,具有准确、速度快、通量高等优点,是临床实验室病原体测定的首选方法。

  利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

  参考文献

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