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细菌染色中苯胺结晶紫染色法的运用
发布时间:2021-06-23

  关键词 :     苯胺结晶紫染色法;细菌染色,影响因素,

  细菌是最常见的一类病原微生物,是具有细胞壁的单细胞生物[1]。常规染色不能明确把细菌显现出来,需要特殊染色才能观察。一般细菌常用的方法是选用革兰氏染色法,所用的碱性染料(结晶紫等)与细菌的核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合,因此,革兰氏阳性菌摄取结晶紫多且较牢固,其结果呈蓝色或紫色,而革兰氏阴性菌缺乏或含核糖核酸镁盐极少,即易被酸性复红和中性红等染成红色[2]。显示革兰氏阳性菌都是以苯甲烷类染料如结晶紫和龙胆紫等作为主要染料[1]。我科常用的方法为苯胺结晶紫染色法,现介绍如下:

  1、 材料与方法

  1.1 、组织来源

  组织取自本院收集的有关细菌的病例。组织固定于4%中性缓冲甲醛液,按常规脱水包埋,常规石蜡制片,切片厚3~4μm。

  1.2、 试剂的配制

  (1)1%曙红液:曙红Y(esoin Y) 1 g,蒸馏水100 ml。(2)苯胺结晶紫染液:结晶紫2 g,无水乙醇10 ml,苯胺2 ml,蒸馏水88 ml。把结晶紫溶于无水乙醇,把苯胺与蒸馏水盛于小口砂塞瓶内摇匀混合。过滤后再与结晶紫无水乙醇混合,用前过滤。此液约可保存数月。(3)Weigret氏碘液:碘片1 g,碘化钾2 g,蒸馏水100 ml。(4)苯胺二甲苯液:苯胺1份,二甲苯2份。

  1.3、 操作方法

  (1)切片脱蜡至水。(2)用明矾苏木精浅染细胞核。(3)流水冲洗10 min。(4)1%曙红液于56℃温箱内染色10 min。(5)稍水洗。用苯胺结晶紫液染色10 min。(6)倾去染液,用滤纸稍吸干切片周围染液。(7)用Weigret氏碘液直接滴在切片上,约2 min。(8)稍水洗,用滤纸彻底吸干水份。(9)苯胺二甲苯进行分化,并轻轻摇动切片,必要时可更换新的分化液,至无颜色脱出。立即倾去切片上的苯胺二甲苯。(10)入新的二甲苯,以去除苯胺,然后在镜下观察,至切片显示清晰为止。(11)用二甲苯反复多次洗切片,彻底把苯胺除去。(12)用中性树胶封固切片。
 

细菌染色中苯胺结晶紫染色法的运用
 

  2、 结果

  革兰氏阳性菌呈蓝紫色,细胞核蓝黑色,其他组织粉红色(图1)。水洗时间,残留水分及分化时间均对染色有一定影响(图2~4)。

  图1 肺组织苯胺结晶紫染色法:箭头(→)示革兰氏阳性菌中倍放大
图1 肺组织苯胺结晶紫染色法:箭头(→)示革兰氏阳性菌中倍放大

  图2 肺组织苯胺结晶紫染色法:曙红液染色后水洗时间过长,曙红不上色或颜色浅中倍放大
图2 肺组织苯胺结晶紫染色法:曙红液染色后水洗时间过长,曙红不上色或颜色浅中倍放大

  图3 肺组织苯胺结晶紫染色法:分化不均匀,箭头(→)示因分化不均匀致结构不清的革兰氏阳性菌中倍放大
图3 肺组织苯胺结晶紫染色法:分化不均匀,箭头(→)示因分化不均匀致结构不清的革兰氏阳性菌中倍放大

  图4 肺组织苯胺结晶紫染色法:分化过度,箭头(→)示因分化过度致脱色的革兰氏阳性菌中倍放大
图4 肺组织苯胺结晶紫染色法:分化过度,箭头(→)示因分化过度致脱色的革兰氏阳性菌中倍放大

  3、 讨论

  不同细菌的等电点不同,革兰氏阳性细菌等电点为PH2.0~3.0,革兰氏阴性细菌等电点为PH4.0~5.0,阳性细菌带的负电荷比阴性细菌带的负电荷多,与带正电荷的碱性染料结晶紫结合,再加入媒染剂(碘)进入菌体后,与染料结合形成不溶于水的结晶紫-碘-蛋白复合物,并与阳性细菌菌体内的核糖核酸镁盐结合,使已着色的细菌不易脱色。而分化剂(苯胺、丙酮等)不易透过阳性菌的细胞壁,故阳性菌不易脱色;但分化剂容易进入阴性菌菌体内,溶解染料和碘复合物,使阴性细菌脱色[1,2]。

  苯胺结晶紫染色法简单,易操作,染色良好的切片镜下细菌形态明显,易判断其染色性。实验结果显示:(1)曙红染色后水洗时间过长,易导致背景染色偏浅,主要原因是所用的曙红为水溶性,易溶于水,水洗时间过长,会导致背景褪色。解决方法:在日常工作中,应将切片在曙红液中深染[1],同时也要控制好水洗时间。(2)经Weigret氏碘液和稍水洗后,如切片上残留有水分,会导致分化不均匀。解决方法:在分化前,应用滤纸把切片吸干,再滴入苯胺二甲苯进行分化,可避免此情况发生。(3)分化时间过长,不仅使背景褪色,还会使所染上的革兰氏阳性菌、细胞核一并褪色,导致染色结果呈假阴性[3]。分化时间长使得细胞壁中脂类物质易被溶解,细胞壁的孔径及通透性增加,导致结晶紫-碘复合物易被抽提出;反之,脱色时间短,复合物就不易从细胞壁中逸出[4,5]。解决方法:在操作中应注意分化时间不宜过长,一般在稍分化后以二甲苯漂洗,置显微镜下观察,若见革兰氏阳性细菌呈清晰的蓝紫色小点时,则立即结束分化。(4)革兰氏染色为一种退行性染色,最后一定要用二甲苯反复多次洗去苯胺,否则标本容易褪色[1]。

  在病理诊断中应用该染色法,不仅操作简单,弥补了H-E染色法的不足之处,而且也有助于有关细菌病例的诊断以及临床选用抗菌药物进行治疗。

  参考文献

  [1]凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术[M].广 东广东高等教育出版社: 1989:33-39.
  [2]全国卫生专业技术资格考试用书编写专家委员会. 2017全国卫生专业技术资格考试指导病理学技术[M] .北京:北京卫生出版社:2016:420-421.
  [3]李汝佳.改良革兰氏染色法在病理实验教学中的应用[J] .医学伦理与实践,2012,25(9):1131.
  [4]崔潇婷,洪伟鸣,王妲妲。革兰氏染色技术的实验研究[J]. 考试周刊, 2012,73.
  [5]洪庆华, 迟杰,齐坛,等.影响革兰氏染色结果的原因分析[J] .实验技术与管理, 2011,28(5):41-43.

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